程浩 小鼠脾脏单细胞悬液制备流程及注意事项 小鼠脾脏单细胞悬液制备流程 a) 研磨法 1. 小鼠颈椎脱臼处死,置于75%酒精浸泡5 min后,取出小鼠,置于无菌操作台上,左腹侧朝上。 2. 小鼠左腹侧中部剪开小口,撕开皮肤,暴露腹壁,可见红色长条状脾脏。 3. 脾脏下侧提起腹膜,剪开后上翻,暴露出脾脏。用镊子提起脾脏,眼科剪分离脾脏下面的结缔组织,取出脾脏,并浸泡于干净的PBS溶液中。 4. 将脾脏置于200目筛网中,用组织研磨棒轻轻研磨至... 样本制备指南 2022-06-07
程浩 小鼠淋巴结单细胞悬液制备及注意事项 小鼠淋巴结单细胞悬液制备流程 1. 将小鼠颈椎脱臼处死,75%酒精浸泡5 min,取出小鼠,腹部朝上置于无菌操作台上。 2. 用剪子从胸骨起沿正中线一直到颌下将皮肤剪开,再从颌下向左右耳根的方向切开皮肤。用镊子夹着皮肤向左右掀开并用针固定,即可见到胸骨上方的一对体积较大的颌下腺。在左右颌下腺各自的上缘,附着有黄色的颈前部淋巴结。剪断胸锁乳突肌和肌腹,并掀起它们两个断端,可见到左颌下腺背侧深部左、右... 样本制备指南 2022-06-07
程浩 小鼠骨髓单细胞悬液制备流程及注意事项 小鼠骨髓单细胞悬液制备流程 1. 颈椎脱臼法处死小鼠,放在75%酒精中浸泡5 min。提前于超净台上准备一个消毒托盘(可用无菌口罩或者用浸满酒精的纱布代替),取出小鼠并铺于消毒托盘上。 2. 在无菌环境下取小鼠的后肢骨。用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤,用眼科剪小心剪开,并分离两下肢的皮肤。将皮肤往下在脚踝处剪断,往上在髋关节处剪断,游离出小鼠的两条后肢。 3. 小心剥离肌肉(肌肉两端的... 样本制备指南 2022-06-07
程浩 小鼠腹水及单细胞悬液制备及注意事项 小鼠腹水及单细胞悬液制备流程 1. 配制6%淀粉肉汤 。 6%淀粉肉汤配制方法:牛肉膏 0.3 g、蛋白胨 1.0 g、氯化钠 0.5 g、蒸馏水 100 mL,上述材料混合加热后加入可溶性淀粉6.0 g;溶解后,121℃高压灭菌15~20 min,EP管分装封口,将肉汤放置于4℃保存。 2. 小鼠腹腔注射1 mL 6%淀粉肉汤(注意避开肠管和内脏),刺激60~72 h。 3. 颈椎脱臼法处死小鼠... 样本制备指南 2022-06-07
程浩 人外周血单细胞悬液制备流程及注意事项 人外周血单细胞悬液制备流程 1 . 采集人外周血样本于抗凝管中。 2. 离心管内加入100 μL新鲜血和2 mL 1×红细胞裂解液,混匀,4℃裂解10 min。 3. 300 g离心5 min(裂解完立即离心,防止时间过长损伤细胞),弃上清,得到白色细胞沉淀。 4. PBS洗涤一次。 5. 加入100 μL细胞染色缓冲液重悬细胞,不用计数,即可进行后续流式抗体染色实验。按照100 μL新鲜血样本制... 样本制备指南 2022-06-07
程浩 人外周血PBMC的制备及注意事项 人外周血 PBM C 的制备流程 1. 收集抗凝人外周血,用1640无血清培养基或PBS按照1:1的比例稀释,上下颠倒混匀或者用移液枪吹打混匀。 2. 在15 mL离心管中,先加入3 mL 充分混匀的Ficoll液(1.077 g/mL),再沿着管壁缓慢加入2 mL稀释后的血液,血液和Ficoll液分层明显为成功。 注:Ficoll提前半小时从4℃冰箱取出恢复到室温,温度过高会导致分离不明显,温度... 样本制备指南 2022-06-07
程浩 流式对照设置之同型对照 #01 什么是同型对照? 同型对照(Isotype Control),是指与使用的流式抗体具有相同种属来源、亚型、荧光标记物、使用剂量和浓度,但对目标靶点无特异性结合的抗体 。同型对照通常用来消除抗体与抗原的非特异性结合造成的背景染色。 #02 为什么要做同型对照? 流式抗体与靶标的结合,是通过抗体的Fab端与靶标Marker进行特异性结合而完成的。白细胞(除T细胞外)表面大多表达CD16、CD3... 流式课堂 2022-06-01
程浩 流式实验对照设置之单阳对照 多色流式实验 中,由于不同荧光素的发射波长的覆盖范围不同,可能产生重叠,对实验结果的数据分析造成一定干扰,我们通常会设置单阳管进行调节补偿。同时,单阳管还可以辅助我们调节通道电压,防止信号超出接收范围。 图示:常见荧光素的发射光谱 A. 如何设置单阳管 单阳管即单染管,是只添加一种荧光抗体的样本管。 一般来说,实验panel有几种荧光,就需要设置几个单阳管。如:APC、PE、FITC的三色pane... 流式课堂 2022-05-16
程浩 联合CD45及SSC设门的意义 在《 人外周血调节性T细胞鉴定方案 》中,我们用到了CD45这个指标圈门。有疑问指出: 人外周血中,所有的白细胞表面都表达CD45,做外周血的样本不需要多此一举,去添加一个 CD45抗体 。通过FSC/SSC,就能直接圈出淋巴细胞亚群 。 做免疫细胞分型时,CD45真的可有可无吗?下面我们来聊一聊, CD45的特点,及通过CD45与SSC-H来圈出淋巴细胞亚群的意 义 。 CD45由一类结构相似、... 流式课堂 2022-04-14
程浩 人外周血调节性T细胞鉴定方案 CD127 VS Foxp3 虽然Foxp3是目前公认的调节性T细胞最特异的指标,但因其位于细胞内,使得Foxp3的染色必须要固定细胞并破核膜,因此 这种方法并不适用于分离活的Tregs, 且该方法比较传统,操作相对复杂,稍有不慎就会影响实验结果 。 而CD127属于细胞表面Marker,无需固定破膜。因此,当前主流方向是通过CD127来检测人Tregs。 CD127的发现 CD127是2006年... 流式课堂 2022-04-07
程浩 小鼠调节性T细胞鉴定方案 小鼠调节性T细胞 鉴定步骤 配色方案 细胞亚群 种属 指标 荧光标记 克隆号 Treg Mouse CD4 FITC GK1.5 CD25 APC PC-61.5.3 Foxp3 PE 3G3 小鼠调节性T细胞 鉴定所需 流式抗体 产品名称 荧光素 货号 规格 CD4 FITC E-AB-F1097C 100T CD25 APC E-AB-F1102E 20T Foxp3 PE E-AB-F123... 流式课堂 2022-03-22
程浩 流式配色基本原则 流式细胞实验操作其实是非常简单的一个实验: 样本制成单细胞悬液+抗体加进去染色 实验就做完了 对于大多数新手来说 流式细胞实验前的指标选择和配色才是大家关注的重点 很多人通过文献知道自己要做什么指标 但不理解文献里面为什么要这样配色 是基于什么原因来做配色方案的? 下面,我们为大家带来“流式配色基本原则” 流式配色遵循以下基本规则: 强弱搭配 选择干扰少的荧光组合 使分析的复杂程度降到最低 谨慎使... 实验指南及答疑 2022-03-14