小鼠调节性T细胞鉴定步骤
配色方案
细胞亚群 |
种属 |
指标 |
荧光标记 |
克隆号 |
Treg |
Mouse |
CD4 |
FITC |
GK1.5 |
CD25 |
APC |
PC-61.5.3 |
||
Foxp3 |
PE |
3G3 |
小鼠调节性T细胞鉴定所需流式抗体
产品名称 |
荧光素 |
货号 |
规格 |
FITC |
E-AB-F1097C |
100T |
|
APC |
E-AB-F1102E |
20T |
|
PE |
E-AB-F1238D |
20T |
小鼠调节性T细胞鉴定所需辅助试剂
作用 |
货号 |
名称 |
规格 |
同型对照 |
E-AB-F09822E |
APC Rat IgG1,κ Isotype Control
|
20T |
同型对照 |
E-AB-F09792D |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control
|
20T |
细胞染色缓冲液 |
E-CK-A107 |
100mL |
|
红细胞裂解液 |
E-CK-A105 |
100mL |
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固定破膜液 |
E-CK-A108 |
Foxp3/TranscriptionFactor Staining Kit
|
20 Assays |
样本管设置
目的 |
样本 |
设置 |
调电压 |
1 |
Black(空白管) |
调补偿 |
2 |
CD4-FITC |
3 |
CD25-APC |
|
4 |
Foxp3-PE |
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同型对照 |
5 |
CD4-FITC 、Foxp3-PE 、APC Rat IgG1, κ Isotype Control |
6 |
CD4-FITC 、CD25-APC、PE Mouse IgG1, κ Isotype Control |
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Full Panel |
7 |
CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE |
一、小鼠脾细胞分离步骤:
1. 取小鼠脾脏,置于PBS中;
2. 可用注射器柱塞研磨脾脏,并通过70μm细胞过滤器过滤,收集滤液到15mL离心管;
3. 300g离心5min,弃上清,得到红色细胞沉淀;
4. 加2mL 1x 红细胞裂解液,重悬沉淀,室温下裂解2~3min,再加10mL PBS,终止裂解反应;
5. 300g离心5min,弃上清,得到白色细胞沉淀,用细胞染色缓冲液重悬细胞,并做细胞计数,调整细胞浓度为1×107/mL。
二、细胞固定破膜实验步骤:
(下面是全染管的实验步骤,空白组不加抗体,单染管只在对应步骤加对应流式抗体,同型对照组将相应的流式抗体替换成同型对照,所有组都要固定破膜)
1 .根据检测的量,稀释Foxp3检测专用的固定剂和破膜剂;
2. 取100μL小鼠脾脏细胞(1×106个细胞),置于流式管内,加入1Test的FITC Anti-Mouse CD4(E-AB-F1097C)和1Test的APC Anti-Mouse CD25(E-AB-F1102E)混匀,4℃孵育30min;
3. 孵育完毕后,加入1mL细胞染色缓冲液,300g离心5min,弃上清,再加入100μL细胞染色缓冲液,重悬细胞;
4. 加入1mL固定剂,涡旋混匀,4℃反应30min;反应完成后,600g离心5min,弃上清;
5. 加入2mL破膜剂,涡旋混匀,600g离心5min,弃上清;
6. 重复步骤 5;
7. 加入100μL破膜剂,重悬细胞,再加入PE Anti-Mouse Foxp3(E-AB-F1238D),混匀后室温孵育30min;
8. 加入2mL破膜剂,600g离心5min,弃上清;
9. 加入200μL细胞染色缓冲液,重悬细胞,即可上机检测。
实验结果
小鼠脾脏Treg细胞表型分析
解析:
▶ 荧光素间有溢漏,故需要设置单阳管,用于调节补偿;
▶ CD4分群明显,无需同型对照;CD25和Foxp3分群不明显,需同型对照;
▶ 本实验取正常小鼠脾脏验证,无生物学对照;
▶ 圈门路径:
首先,根据FSC-A和SSC-A圈中目的细胞;
其次,利用光散射特性,去黏连,得到单细胞;
再次,通过CD4,确定CD4+辅助T细胞;
最后,通过CD25+/Foxp3+,确定出Treg细胞亚群。