人外周血单细胞悬液制备流程
1. 采集人外周血样本于抗凝管中。
2. 离心管内加入100 μL新鲜血和2 mL 1×红细胞裂解液,混匀,4℃裂解10 min。
3. 300 g离心5 min(裂解完立即离心,防止时间过长损伤细胞),弃上清,得到白色细胞沉淀。
4. PBS洗涤一次。
5. 加入100 μL细胞染色缓冲液重悬细胞,不用计数,即可进行后续流式抗体染色实验。按照100 μL新鲜血样本制备的单细胞悬液,加入1 Test对应的流式抗体混匀进行后续实验。
人外周血FSC/SSC图
人外周血CD45/SSC图
注意事项:
1. 采血用抗凝管,有肝素和EDTA两种。若直接裂解红细胞进行表面指标染色实验,两种抗凝管都可使用;如果是采血后检测细胞因子,则必须使用肝素抗凝。
2. 裂解液推荐使用10× ACK Lysis Buffer(E-CK-A105),不含固定剂。
3.10× ACK Lysis Buffer实验前需用纯水稀释成1×,现配现用,推荐放在4℃条件下暂存,当天使用。
4. 检测人外周血中常规指标,可用过夜保存的样本,一般来说问题不大。但是对于表达量比较低的指标,建议用新鲜的样本检测。
5. 第三步裂解完后离心弃上清时,建议用移液枪轻轻吸走残液。如果直接倒掉,离心管内会有残留裂解液,后续加入100 μL PBS重悬细胞时,可能不能完全稀释裂解液,导致红细胞裂解过度。
6. 细胞沉淀重悬,可用枪轻轻吹打,或者用转速小的涡旋仪涡旋。
7. 人血样本建议染CD45,有利于后续数据分析时圈门。
8. 处理人血样本时,推荐设置只染CD45的单染管低速上机用来设置阈值,观察细胞量,圈淋巴细胞群。
9. 人外周血中主要含T淋巴细胞,B淋巴细胞的量较少。如果使用病人的血液样本,B淋巴细胞的量可能更少,因此B淋巴细胞的检测不推荐使用过夜的样本,过夜样本易导致检测信号低。