人外周血PBMC的制备流程
1. 收集抗凝人外周血,用1640无血清培养基或PBS按照1:1的比例稀释,上下颠倒混匀或者用移液枪吹打混匀。
2. 在15 mL离心管中,先加入3 mL 充分混匀的Ficoll液(1.077 g/mL),再沿着管壁缓慢加入2 mL稀释后的血液,血液和Ficoll液分层明显为成功。
注:Ficoll提前半小时从4℃冰箱取出恢复到室温,温度过高会导致分离不明显,温度过低会导致密度过大,同样分离效果不好, 20~25℃最佳。。
3. 将样本小心转移到离心机,500 g离心25 min。
4. 小心取出离心管,吸取中间层的白色薄膜层,即为单个核细胞。
5. 用10 mL PBS洗涤获得的单个核细胞,250 g离心10 min,弃上清。
6. 重复洗涤一次。
7. 用细胞染色缓冲液重悬细胞备用。
人外周血PBMC流式FSC/SSC图
注意事项:
1. Ficoll使用时的温度很重要,温度太高或者太低都会影响分离效果。
2. 血液样本最好为新鲜抗凝血(采血2 h 以内),为保持细胞活力,应避免冷冻和冷藏。
3. 50 mL离心管离心效率比15 mL离心管差,为了获得最大量的单核细胞,最好用15 mL离心管,且离心管使用量不要超过三分之一,可以将血样进行等分后加入多个离心管。
4. 分选后的细胞样本直接诱导阻断进行细胞因子的检测,效果最佳,分选后的样本也可冻存,需要的时候再诱导检测。
5. 诱导阻断后来不及检测的样本,最好冻存,并在3天内检测效果最好。冻存液推荐使用90%的FBS+10%的DMSO。冻存24 h再检测,结果无大的影响;冻存3天再检测,CD3和IFN-γ表达略有降低;冻存1周后再复苏检测,CD3和IFN-γ表达较大幅度降低。
9. Ficoll分离液分离后图片: