人外周血PBMC的制备及注意事项
流式实验中,样本制备过程至关重要,制备合格的样本,可以帮助获取更好的实验结果。Elabscience整理了制备人外周血PBMC的制备方法及注意事项,帮助客户获取合格的人外周血PBMC实验样本,从而在实验中获得更准确的结果。

人外周血PBMC的制备流程

1. 收集抗凝人外周血,用1640无血清培养基或PBS按照1:1的比例稀释,上下颠倒混匀或者用移液枪吹打混匀。

2. 在15 mL离心管中,先加入3 mL 充分混匀的Ficoll液(1.077 g/mL),再沿着管壁缓慢加入2 mL稀释后的血液,血液和Ficoll液分层明显为成功。

注:Ficoll提前半小时从4℃冰箱取出恢复到室温,温度过高会导致分离不明显,温度过低会导致密度过大,同样分离效果不好, 20~25℃最佳。。

3. 将样本小心转移到离心机,500 g离心25 min。

4. 小心取出离心管,吸取中间层的白色薄膜层,即为单个核细胞

5. 用10 mL PBS洗涤获得的单个核细胞,250 g离心10 min,弃上清。

6. 重复洗涤一次。

7. 用细胞染色缓冲液重悬细胞备用。

人外周血PBMC流式FSC/SSC图

注意事项:

1. Ficoll使用时的温度很重要,温度太高或者太低都会影响分离效果

2. 血液样本最好为新鲜抗凝血(采血2 h 以内),为保持细胞活力,应避免冷冻和冷藏。

3. 50 mL离心管离心效率比15 mL离心管差,为了获得最大量的单核细胞,最好用15 mL离心管,且离心管使用量不要超过三分之一,可以将血样进行等分后加入多个离心管。

4. 分选后的细胞样本直接诱导阻断进行细胞因子的检测,效果最佳,分选后的样本也可冻存,需要的时候再诱导检测。

5. 诱导阻断后来不及检测的样本,最好冻存,并在3天内检测效果最好。冻存液推荐使用90%的FBS+10%的DMSO。冻存24 h再检测,结果无大的影响;冻存3天再检测,CD3和IFN-γ表达略有降低;冻存1周后再复苏检测,CD3和IFN-γ表达较大幅度降低。

9. Ficoll分离液分离后图片:


流式细胞术样本制备技术
单细胞是流式细胞术对细胞进行分析检测的前提条件。在应用流式细胞术中,制备出合格的分散单细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它既要求组织分散成为单个细胞,又要维持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。Elabscience总结了常见样本的制备操作过程,帮助客户制备出合格的,分散的单细胞悬液。