程浩 免疫荧光常见问题分析 问题 原因 建议 背景过高 一抗质量不高 使用特异性高、效价高的一抗 一抗 / 二抗浓度太高 降低一抗 / 二抗浓度 封闭不完全 增加蛋白封闭时间 洗涤不充分 增加冲洗次数与时间 可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景 信号弱或无信号 无目的蛋白或表达量极少 选用表达量高的细胞或组织 细胞通透性差 增加通透剂的作用时间或浓度 一抗 / 二抗浓度太低 增大其浓度 二抗选择错误(种属不匹配) 选用与一抗... 实验指南及答疑 2017-09-01 蛋白抗体资源
程浩 Western Blot常见问题分析 问题 可能原因 解决方法 背景值高 膜没有均匀浸润 PVDF 膜转膜前用 100% 甲醇将膜完全浸湿,转膜前用缓冲液浸泡 10min 膜或者缓冲液污染 拿取膜与吸水纸时要戴手套,更换新鲜转膜缓冲液 封闭不充分 更换封闭液或延长封闭时间 抗体与封闭液出现交叉反应 检测一抗、二抗与封闭液是否有交叉反应 抗体浓度过高 做预实验检测确定一抗、二抗的最佳工作浓度 杂带多 一抗不是唯一特异的 制备单克隆抗体或... 实验指南及答疑 2017-09-01 蛋白抗体资源
程浩 免疫印迹实验相关原理介绍 免疫印迹(Western blot)简介和原理 免疫印迹用于鉴定能够与特异性抗体相互作用的大分子抗原(一般为蛋白质)并测定抗原的大小。蛋白质首先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,再通过电泳转移到固相支持物上,固相支持物包括硝酸纤维素膜,聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和阳离子尼龙膜等。首先把膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附,这样固定的蛋白即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用。最后通过... 实验指南及答疑 2017-09-01 蛋白抗体资源
程浩 IHC原理、操作及注意事项 免疫组织化学 ( Immunohistochemistry , IHC ) 是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的一项技术。 IHC的实验流程和方法总体不难,但做出漂亮的染色结果却不容易,所谓“细节决定成败”,也正是IHC实验中尤为重要的关键点。那么“细节”主要是哪一些呢?... 实验指南及答疑 2017-09-01 蛋白抗体资源
程浩 IHC常见问题分析及处理 问题 原因 建议 结果中显色过深 一抗浓度过高或孵育时间过长 降低一抗浓度或减少孵育时间 孵育温度过高 室温或 4 ℃孵育 HRP 标记二抗孵育时间过长 缩短时间 IHC 结果中非特异性显色 石蜡切片脱蜡不彻底 延长脱蜡时间 操作过程中冲洗不充分 增加冲洗的次数与冲洗时间 组织富含内源性的生物素与过氧化物酶 使用相关试剂进行封闭 发生抗原异位 蛋白封闭不充分 增加蛋白封闭时间 IHC 结果中显色强... 实验指南及答疑 2017-09-01 蛋白抗体资源
程浩 缓冲液配制指南 Buffer配方 1.0 mol/L TrisHCl(pH 6.8) Tris 30.28 g 超纯水 200 mL 溶解后,用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250 mL,高温灭菌后室温下保存。 1.5mol/L TrisHCl(pH 8.8) Tris 45.43 g 超纯水 200 mL 溶解后,用浓盐酸调pH至8.8,最后用超纯水定容至250mL,高温灭菌后室温下保存。 10% S... 实验指南及答疑 2017-09-01 蛋白抗体资源
程浩 Western实验步骤 样本准备 1. 蛋白提取 所需仪器:匀浆器、RIPA裂解液、PMSF(蛋白酶抑制剂)、磷酸酶抑制剂、剪刀、镊子,消毒酒精棉、PBS、移液器、离心机。 裂解液配制——RIPA裂解液:PMSF=100:1。 1) 组织处理: 首先用酒精棉消毒剪刀和镊子,取适量的组织于匀浆器中,用剪刀剪碎加适量的裂解液冰水中匀浆1-4 min。匀浆结束后吸取溶液于EP管中保存备用。(含血液较多的组织可先用PBS清洗后再... 实验指南及答疑 2017-09-01 蛋白抗体资源
程浩 ELISA常见问题 问题描述 可能原因 相应对策 精确度低 洗涤不完全 保证洗板机正常运行 保证充足的浸泡时间 拍板不完全 充分拍板至孔内无明显残留液体 试剂混合不充分 保证溶液充分混合 溶液被污染 重新配制溶液 标准品稀释不正确 稀释液作为空白值;保证用最高浓度标准品精确稀释 保证按正确倍比梯度稀释 标准曲线梯度差 洗涤不完全 保证洗板机正常运行 拍板不完全 充分拍板至孔内无残留液体 每孔加液体积不等 检查移液器 ... 实验指南及答疑 2017-08-31 ELISA研究
程浩 移液时的注意事项 移液的一致性是实验重复性好的关键。移液时必须保持平稳、一致的速度。吸液和加液时要避免突然挪动移液器。 1. 检查移液器枪头,确保其正确安装在移液器末端。 2. 加不同的试剂和样品时需更换枪头。 3. 加液的体积不能少于说明书上建议的体积,否则会降低实验的准确性和重复性。 4. 一些溶液可能容易吸附在枪头的内壁或外壁,用样本或试剂来润洗枪头可降低或避免液体的表面张力,从而提高实验的准确性。 5.针对... 实验指南及答疑 2017-08-31 ELISA研究
程浩 如何清洗ELISA酶标板 正确地清洗酶标板是成功完成 ELISA 实验的关键之一。稀释浓缩洗涤液时应使用去离子水或蒸馏水。 以下是正确清洗酶标板的注意事项: 使用多通道移液器 首先,检查酶标板确保其牢固放置于板架上。随后,翻转酶标板倾倒液体。按照说明书所示体积在每孔加入洗涤液。按照推荐的时间,计时器设置洗涤液浸泡时间。再次翻转酶标板倒出液体,用干净的吸水纸轻拍,将孔内液体拍干。按照说明书建议的次数重复以上步骤。最后一次在吸... 实验指南及答疑 2017-08-30 ELISA研究
程浩 如何提高ELISA的精确重现性 免疫检测法的精确性表现为单次实验孔间(批内)的重复性和多次实验之间(批间)的重复性。CV值高则表明精确度低,通常由以下两个原因造成:移液技术和洗涤技术。 移液技术 1. 移液时,枪头应对准孔中央,避免接触孔壁及底部。 2. 移液后轻轻晃动混匀试剂。 3. 如果您的样品具有黏性,请预先润洗枪头以消除表面张力的影响。吸液时等待片刻使体积平衡后再取出。 4. 移液不充分或移液体积不均,说明移液器需要校正... 实验指南及答疑 2017-08-30 ELISA研究
程浩 ELISA提示 ELISA 实验失败可能由多种因素造成。在实验前阅读并充分了解产品说明书,可以一定程度上避免出现意想不到的结果。 参考以下提示来避免实验出现问题。 1. 检查试剂盒的保质 期,保 证所有试剂按说明书上的建议正确保存; 2. 检查试剂溶液是否存在不稳定或降解迹象,如沉淀或变色等; 3. 底物溶液应为无色; 4. 试剂制备和保存时应使用干净的一次性塑料吸量管、枪头和容器。每次加液(样品、标准品及其他试... 实验指南及答疑 2017-08-30 ELISA研究