程浩 流式细胞表面染色步骤 一、样本准备 详见 流式细胞 术样本制备技术 1. 收集细胞,200目筛网过滤,收集滤液,300 g离心5 min,弃上清 2. 向细胞中加入适量细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS),用移液枪轻轻吹打细胞重悬 二、细胞计数 用血球计数板或其他仪器对悬液进行计数后,调整细胞浓度约为1 × 10 7 /mL 三、设置实验分组 实验分组 作用 阴性/空白对照 调节仪器电压 单染/单阳对照 调节... 实验指南及答疑 2018-08-01 流式细胞术
程浩 免疫组化试剂盒实验操作步骤 仪器、设备: 移液器、免疫组化笔、微波炉或高压锅、计时器、孵育湿盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶等。 溶液配制: PBS溶液配制;EDTA组织抗原修复液及DAB显色液使用详见免疫组化试剂盒产品说明书操作步骤。 实验温度: 15-28℃ 实验步骤: 1. 脱蜡水化 1) 石蜡切片置于新鲜的二甲苯中,浸泡15 min × 2次; 2) 去除多余的液体后,置无水乙醇中,浸泡3 min × 2次; 3... 实验指南及答疑 2018-07-16 蛋白抗体资源
程浩 流式实验常见问题及解决方案 1.无染色/弱染色 可能的原因 解决方法 抗体贮存和操作不当 抗体应保存在2-8℃中,避光保存,同时避免反复冻融 荧光染料淬灭 荧光抗体和荧光抗体染色后的样本都应该避 光保存 自发荧光较高 改变抗体的荧光染料形式,避开与自发荧光相同发射光或者补偿较大的染料 染色时间和温度不正确 适当调整染色时间和温度 使用错误的染色液染色细胞内蛋白 为了获得最佳细胞内蛋白染色,应该使用正确的固定破膜剂进行细胞固定... 实验指南及答疑 2017-12-23 流式细胞术
程浩 流式细胞术实验流程 流式细胞技术(Flow cytometry, FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物,它能有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体,检测对象包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液和其他生物颗粒。 一、细胞表面染色步骤 1. 样本准备 1.1 采集全血或组织(脾,淋巴结... 实验指南及答疑 2017-12-22 流式细胞术
程浩 HRP底物分类 底物范围较广,包括二氨基联苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。 二氨基联苯胺/金属盐 DAB是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。它产生强烈的棕色产物,在水和醇中不溶解。多数情况下,推荐在DAB中加入不同的金属离子。当加入金属盐如钴、镍至底物液中,辣根过氧化物酶可以更加敏感。此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色,且在水及醇中稳定。DAB/金属盐染色应用的组织染色范围较广。 1. 需要的溶液和特殊设备 DA... 实验指南及答疑 2017-09-02 ELISA研究
程浩 ELISA实验操作要点 优质的试剂,良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异,国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点,珠式、管式及磁性球ELSIA,国外试剂均与特殊仪器配合应用,两者均有详细的使用说明,严格遵照规定操作,必能得出准确的结果。 1. 标本的采取和保存 可用作 ELISA测定的标本十分广泛,体液(如血清... 实验指南及答疑 2017-09-02 ELISA研究
程浩 生物素亲和素ELISA系统介绍 生物素亲和素(又称抗生物素)系统(biotin avidin system,BAS)标记抗体的技术是20世纪70年代后期发展起来的一种新的免疫检测方法。由于亲和素与生物素间的亲和力极强,结合迅速,且极其稳定,生物素标记抗体和酶的标记率高,又不影响蛋白的活性,使BAS标记技术比常规酶联免疫、放射免疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度,为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。近年来,在BAS检测中多用链霉亲... 实验指南及答疑 2017-09-02 ELISA研究
程浩 ELISA中的抗原与抗体的反应 抗体的结构 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类,即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为 IgG和IgM。Ig由两个轻链(L)和两个重链(H)的单体组成。Ig的轻链是相同的,有κ(kappa)和λ(Lambda)两种型别。五类Ig的重链结构不同,这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ(gamma)链... 实验指南及答疑 2017-09-02 ELISA研究
程浩 ELISA原理与分类 一、ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量... 实验指南及答疑 2017-09-02 ELISA研究
程浩 石蜡切片免疫组化实验步骤 脱蜡和水化 1. 将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10 min,二甲苯Ⅱ(10 min)。 2. 再次浸入无水乙醇Ⅰ(5 min)-无水乙醇Ⅱ(5 min)-95%酒精(5 min)-80%酒精(5 min)-70%酒精(5 min),然后去离子水冲洗2次,每次2 min。 抗原修复 (可选) 3. 将组织切片放入修复盒,然后加入适量0.01M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)或EDTA修复液(pH 9.0),液... 实验指南及答疑 2017-09-02 蛋白抗体资源
程浩 免疫荧光实验指南 固定和透化 1. 在培养板中将已爬好细胞的盖玻片用1 × PBS浸洗3次,每次3 min。 2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min,1 × PBS浸洗玻片3次,每次3 min。 3. 0.5% Triton X-100(1× PBS配制 )室温通透细胞15 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤), 1 × PBS浸洗玻片3次,每次3min。 封闭 4. 吸水纸吸干1 ×PBS,在玻片上滴加5%... 实验指南及答疑 2017-09-02 蛋白抗体资源
程浩 免疫共沉淀实验指南 原理 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是利用抗原和抗体的特异性结合以及Protein A或G特异性地结合到抗体的Fc片段的现象探测两个蛋白分子间是否存在相互作用的一种方法。在细胞裂解液中加入针对蛋白M的抗体,孵育后再加入Protein A或G预处理的Sepharose珠,若细胞中有与蛋白M结合的蛋白N,就可以形成这样一种复合物:“蛋白N-蛋白M—抗蛋白M抗体—Protei... 实验指南及答疑 2017-09-02 蛋白抗体资源