样本准备

1. 蛋白提取

所需仪器：匀浆器、RIPA裂解液、PMSF（蛋白酶抑制剂）、磷酸酶抑制剂、剪刀、镊子，消毒酒精棉、PBS、移液器、离心机。

裂解液配制——RIPA裂解液：PMSF=100：1。

1） 组织处理：首先用酒精棉消毒剪刀和镊子，取适量的组织于匀浆器中，用剪刀剪碎加适量的裂解液冰水中匀浆1-4 min。匀浆结束后吸取溶液于EP管中保存备用。（含血液较多的组织可先用PBS清洗后再匀浆）

2） 细胞处理：

A、 贴壁细胞处理：去掉培养基用PBS清洗后加入适量的裂解液裂解细胞，用移液器适当吹打使细胞脱落，大瓶贴壁细胞可以先用胰酶洗脱下来后再裂解，裂解方法仿照悬浮细胞处理。

B、 悬浮细胞的处理：先将悬浮细胞置于EP管中3000 rpm离心5 min去掉上清培养基，每20 μL体系细胞加100 μL裂解液反复吹打至细胞完全破碎。

处理好的样品12000 rpm离心5 min，取上清即为提取的蛋白。置于4 ℃可保存一周，-20℃可保存约2个月，-80 ℃可保存半年。

2. 蛋白浓度的测定： 酶标板，酶标仪、离心机、1 mg/mL BSA蛋白标准液、BCA试剂、PBS。

1) 标准曲线：用BSA和PBS混合总体积为20 μL的溶液做标准曲线，具体操作如下:按照0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0含量稀释BSA蛋白标准品，每个浓度（0、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μLBSA，其余用PBS补齐至20 μL）梯度做一个复孔。

2) 样品稀释测蛋白浓度：10倍稀释法：取18 μLPBS+2 μL样品上清（经上步处理的样品12000 r/min离心5 min后的上清）每个样品做两个复孔。

20倍稀释法：取19 μLPBS+1 μL样品上清，每个样品做两个复孔。

一般细胞蛋白适用于10倍稀释法，组织蛋白适用于20倍稀释法，总体积为20 μL。

3) BCA试剂的配制：BCA A液：B液比例为50：1，此试剂现配现用，注意勿被其他蛋白污染。

4) 待标准曲线和样品复孔加样后，每孔加入200 μL的BCA混合试剂，置于37 ℃温箱内15 min。用酶标仪在568nm波长下测得OD值。测得的标准曲线OD值按浓度梯度（两个孔）取其平均值减去空白后制作标准曲线得到曲线公式。测得的样品的OD值（三个孔）取其平均值按标准曲线的公式运算得到蛋白浓度，按50 μg/上样孔的标准来计算上样量，算法为：上样量=50/蛋白浓度。注：所有得到的OD值必须减去背景（标曲中空白孔的OD值）后再计算。

3. 样品处理：

蛋白样品：5×SDS上样缓冲液按照4：1比例混合沸水浴10 min左右。浓度过高的样品可用PBS稀释后再煮样。样品煮好后-20 ℃保存待用（可保存半年），样品长期保存须置于-70 ℃。

实验步骤

1. 凝胶配制

1） 根据目的蛋白分子量按比例配制分离胶，缓慢摇动混匀，避免由于剧烈混匀混入氧气。待凝胶溶液混合均匀后，将混匀的凝胶溶液缓慢注入两层玻璃板中，再在液面上小心注入一层无水乙醇，以阻止氧气接触凝胶溶液影响凝胶的聚合，保持水平，在37 ℃恒温箱中静置约1小时，直至凝胶溶液完全聚合凝固。

2） 按比例配制浓缩胶，缓慢摇动混匀，倒掉分离胶上层无水乙醇并用滤纸吸去已凝固分离胶上的无水乙醇，平缓注入浓缩胶溶液，小心插入梳子，避免齿尖产生气泡。在37 ℃恒温箱中静置约1 h，直至凝胶溶液完全聚合凝固，小心拔出梳子，准备上样。

2. 上样

向电泳槽中加入电泳缓冲液，要求两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部，玻璃板内侧液面高于外侧，根据测得浓度计算的样本上样量点样（已处理好的样品，蛋白预染Marker），保证每孔总蛋白量在30-50 μg，确保总上样量体系小于30 μL，注意上样时间尽量短，避免样品扩散。

3. 电泳

上样后，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议80 V)要低于分离胶电泳电压(建议110-150 V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约2-3小时。

4. 电转（湿转法）

1） 电泳结束后取出凝胶，在电泳缓冲液中（冷藏的）漂洗数秒。按“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜液浸透的蛋白转移垫(定性滤纸），将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将转膜液浸透并事先用甲醇浸泡的PVDF膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意PVDF膜与胶，PVDF膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。

2） 转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰水中，确保PVDF膜靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。

3） 转膜选择恒流，每个转印槽建议电流为150-300 mA，时间依据目的蛋白条带分子量大小做适当调整。

4） 转膜结束后，将PVDF膜置于丽春红染色液中，室温5-10分钟即可见红色条带，用洗涤缓冲液洗数次可洗掉红色条带进行后续实验 。

5. 封闭

1） 漂洗印迹膜：使用洗涤缓冲液室温适当漂洗。

2） 取出洗过的印迹膜，放入封闭缓冲液中（5%的脱脂奶粉或5%的BSA），摇床摇动，室温封闭1.5-2小时。

6. 抗体的孵育

主要采用间接法，即先加入未标记的特异性一抗，抗体与膜上的抗原蛋白结合，再加入酶标（过氧化物酶或碱性磷酸酶）二抗进行检测。

1） 向封闭后的印迹膜中加入稀释过的特异性一抗，4 ℃孵育过夜。

2） 洗涤缓冲液洗膜10分钟 ×3次。

3） 加入稀释后酶标二抗，室温孵育1小时，洗膜3-6次，每次10分钟。

7. 检测

根据标记二抗的标记物的不同，其结果检测方法也不同，常用的检测系统有化学发光检测（ECL）和化学显色DAB检测系统。

化学发光检测（ECL）：

1.  利用HRP催化化学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X胶片感光

原理，将结果记录下来。

2.  ECL显色试剂配制：化学发光底物A和B按照1：1比例等体积混匀。

3.  将混合好的显色底物覆盖印迹膜1-5 min，黑暗条件下观察荧光效果。

4.  在暗室可用放射自显影胶片或化学发光成像系统记录结果 。

5.  如采用放射自显影胶片，曝光几秒到数分钟，根据荧光强度控制曝光时间，以显影效果确定所测抗原的正确曝光时间。曝光完的胶

片先在显影液中浸泡至出现条带为止，再放入定影液中固定影像，胶片最后用清水冲洗干净，挂起晾干。

DAB检测：

1.   按照1 mL水加显色剂A、B、C各一滴混匀。

2.   显色：将适量的DAB显色液平铺在杂交后的印迹膜上，室温放置观察，可出现明显的棕黄色蛋白条带。