固定和透化

1.   在培养板中将已爬好细胞的盖玻片用1 × PBS浸洗3次，每次3 min。

2.   用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，1 × PBS浸洗玻片3次，每次3 min。

3.   0.5% Triton X-100(1× PBS配制 )室温通透细胞15 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）, 1 × PBS浸洗玻片3次，每次3min。

封闭

4. 吸水纸吸干1 ×PBS，在玻片上滴加5%的正常血清（与二抗种属来源一致或相似），室温封闭1 h。

抗体孵育

5.    吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜。

6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min。

注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

固定拍照

7.    复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。

8.    用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察采集图像。