程浩 Western Blot常见问题分析 问题 可能原因 解决方法 背景值高 膜没有均匀浸润 PVDF 膜转膜前用 100% 甲醇将膜完全浸湿,转膜前用缓冲液浸泡 10min 膜或者缓冲液污染 拿取膜与吸水纸时要戴手套,更换新鲜转膜缓冲液 封闭不充分 更换封闭液或延长封闭时间 抗体与封闭液出现交叉反应 检测一抗、二抗与封闭液是否有交叉反应 抗体浓度过高 做预实验检测确定一抗、二抗的最佳工作浓度 杂带多 一抗不是唯一特异的 制备单克隆抗体或... 实验指南及答疑 2017-09-01
程浩 免疫印迹实验相关原理介绍 免疫印迹(Western blot)简介和原理 免疫印迹用于鉴定能够与特异性抗体相互作用的大分子抗原(一般为蛋白质)并测定抗原的大小。蛋白质首先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,再通过电泳转移到固相支持物上,固相支持物包括硝酸纤维素膜,聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和阳离子尼龙膜等。首先把膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附,这样固定的蛋白即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用。最后通过... 实验指南及答疑 2017-09-01
程浩 IHC原理、操作及注意事项 免疫组织化学 ( Immunohistochemistry , IHC ) 是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的一项技术。 IHC的实验流程和方法总体不难,但做出漂亮的染色结果却不容易,所谓“细节决定成败”,也正是IHC实验中尤为重要的关键点。那么“细节”主要是哪一些呢?... 实验指南及答疑 2017-09-01
程浩 IHC常见问题分析及处理 问题 原因 建议 结果中显色过深 一抗浓度过高或孵育时间过长 降低一抗浓度或减少孵育时间 孵育温度过高 室温或 4 ℃孵育 HRP 标记二抗孵育时间过长 缩短时间 IHC 结果中非特异性显色 石蜡切片脱蜡不彻底 延长脱蜡时间 操作过程中冲洗不充分 增加冲洗的次数与冲洗时间 组织富含内源性的生物素与过氧化物酶 使用相关试剂进行封闭 发生抗原异位 蛋白封闭不充分 增加蛋白封闭时间 IHC 结果中显色强... 实验指南及答疑 2017-09-01
程浩 缓冲液配制指南 Buffer配方 1.0 mol/L TrisHCl(pH 6.8) Tris 30.28 g 超纯水 200 mL 溶解后,用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250 mL,高温灭菌后室温下保存。 1.5mol/L TrisHCl(pH 8.8) Tris 45.43 g 超纯水 200 mL 溶解后,用浓盐酸调pH至8.8,最后用超纯水定容至250mL,高温灭菌后室温下保存。 10% S... 实验指南及答疑 2017-09-01
程浩 Western实验步骤 样本准备 1. 蛋白提取 所需仪器:匀浆器、RIPA裂解液、PMSF(蛋白酶抑制剂)、磷酸酶抑制剂、剪刀、镊子,消毒酒精棉、PBS、移液器、离心机。 裂解液配制——RIPA裂解液:PMSF=100:1。 1) 组织处理: 首先用酒精棉消毒剪刀和镊子,取适量的组织于匀浆器中,用剪刀剪碎加适量的裂解液冰水中匀浆1-4 min。匀浆结束后吸取溶液于EP管中保存备用。(含血液较多的组织可先用PBS清洗后再... 实验指南及答疑 2017-09-01
程浩 IHC操作视频 本视频为 Elabscience ® 公司免疫组化(石蜡包埋切片)的操作指南,对每一步的反应都做了操作演示,以便实验者能更好地理解免疫组化实验的过程。 石蜡切片免疫组化原理: 将样本固定后包埋到石蜡内,将包埋后的组织切片经脱蜡处理并微波修复抗原,加3%过氧化氢阻断组织内源性过氧化物酶,一抗特异性结合目的蛋白,4 ℃孵育过夜后,37 ℃复温30 min,PBS洗涤干净后加入二抗孵育35 min(二抗... 免疫组化(IHC) 实验操作视频 2017-03-29
程浩 Western Blot操作视频 本视频为 Elabscience® 公司蛋白免疫印迹的操作指南,对每一步的反应都做了演示,以便实验者能更好地理解WB实验的过程。 实验步骤: 1. 样品准备 裂解液(RIPA)准备-----每100 ul RIPA加入1 ul PMSF和1 ul的原钒酸钠溶液,现配现用。加入PMSF,加入原钒酸钠溶液。 组织样本-----黄豆大小组织剪碎,加入200-300 ul配备好的裂解液,冰上研磨,1200... 免疫印迹(WB) 实验操作视频 2017-03-29