程浩 Rt-qPCR如何高效准确加样 Rt-qPCR(实时荧光定量PCR)是分子生物学的基础实验,主要包括三大步骤:RNA提取、逆转录成cDNA、实时荧光定量PCR。虽然看起来逆转录实验只是将几种试剂加在离心管中混匀,进行反应即可,但在实际操作过程中,还有许多细节需要注意。 根据其化学原理不同,Rt-qPCR可以分为2种检测方法: 一种为探针法,如TaqMan探针法;一种为染料法,如SYBR Green Ⅰ染料法。今天来给大家分享一下... 实验指南及答疑 2022-12-14
程浩 免疫荧光试剂盒操作指南 免疫荧光染色试剂盒(Immunol Fluorence Staining Kit)系列是Elabscience®开发的用于细胞或组织切片检测免疫荧光染色的试剂盒。在有适当的一抗检测特定的目标蛋白时,就可以使用免疫荧光染色试剂盒检测到红色、绿色或蓝色等荧光。 推荐Elabscience®的免疫荧光染色的试剂盒 E-IR-R321 免疫荧光染色试剂盒-抗兔Cyanine3 E-IR-R322 免疫荧光... 实验指南及答疑 2019-12-21
程浩 WB实验背景很脏是什么原因?该如何解决? Western Blot实验可以说是生物专业最基础的实验了,然而,虽然WB实验天天做,但是正常高清的结果图并不是你想有就能有。 WB实验出现最多问题的,应该就是各种背景问题了。 你想一下,好不容易实验过五关斩六将做到最后一步,扫描结果出了,是这样的: 为什么明明跑出了想要的趋势,但就是背景脏?怎么让自己的条带不因脏脏的背景而毁了呢? 这里要清楚一点,背景脏不一定是因为仪器不干净造成的,也有可能是蛋... 实验指南及答疑 2019-02-27
程浩 不同分离胶浓度与蛋白分离线性范围 分离胶浓度 线性分离范围 6% 50-150kDa 8% 30-90 kDa 10% 20-80 kDa 12% 12-60 kDa 15% 10-40 kDa... 实验指南及答疑 2018-11-19
程浩 不同浓缩胶体积所对应的各种组分的取样量 各种组分名称 不同浓缩胶体积所对应的各种组分的取样量 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 6 mL 8 mL 10 mL 5%浓缩胶 H 2 O 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30% Acrylamide 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7 1.0M Tris-HCl(pH 6.8) 0.13 0.25 0.38... 实验指南及答疑 2018-11-19
程浩 Western Blot不同分离胶体积所对应的各种组分 各种组分名称 不同分离胶体积所对应的各种组分的取样量 5 mL 10 mL 15 mL 20 mL 25 mL 30 mL 40 mL 50 mL 6% Gel H 2 O 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30% Acrylamide 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.0 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 1.3 2.5... 实验指南及答疑 2018-11-19
程浩 免疫组化试剂盒实验操作步骤 仪器、设备: 移液器、免疫组化笔、微波炉或高压锅、计时器、孵育湿盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶等。 溶液配制: PBS溶液配制;EDTA组织抗原修复液及DAB显色液使用详见免疫组化试剂盒产品说明书操作步骤。 实验温度: 15-28℃ 实验步骤: 1. 脱蜡水化 1) 石蜡切片置于新鲜的二甲苯中,浸泡15 min × 2次; 2) 去除多余的液体后,置无水乙醇中,浸泡3 min × 2次; 3... 实验指南及答疑 2018-07-16
程浩 石蜡切片免疫组化实验步骤 脱蜡和水化 1. 将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10 min,二甲苯Ⅱ(10 min)。 2. 再次浸入无水乙醇Ⅰ(5 min)-无水乙醇Ⅱ(5 min)-95%酒精(5 min)-80%酒精(5 min)-70%酒精(5 min),然后去离子水冲洗2次,每次2 min。 抗原修复 (可选) 3. 将组织切片放入修复盒,然后加入适量0.01M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)或EDTA修复液(pH 9.0),液... 实验指南及答疑 2017-09-02
程浩 免疫荧光实验指南 固定和透化 1. 在培养板中将已爬好细胞的盖玻片用1 × PBS浸洗3次,每次3 min。 2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min,1 × PBS浸洗玻片3次,每次3 min。 3. 0.5% Triton X-100(1× PBS配制 )室温通透细胞15 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤), 1 × PBS浸洗玻片3次,每次3min。 封闭 4. 吸水纸吸干1 ×PBS,在玻片上滴加5%... 实验指南及答疑 2017-09-02
程浩 免疫共沉淀实验指南 原理 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是利用抗原和抗体的特异性结合以及Protein A或G特异性地结合到抗体的Fc片段的现象探测两个蛋白分子间是否存在相互作用的一种方法。在细胞裂解液中加入针对蛋白M的抗体,孵育后再加入Protein A或G预处理的Sepharose珠,若细胞中有与蛋白M结合的蛋白N,就可以形成这样一种复合物:“蛋白N-蛋白M—抗蛋白M抗体—Protei... 实验指南及答疑 2017-09-02
程浩 免疫荧光常见问题分析 问题 原因 建议 背景过高 一抗质量不高 使用特异性高、效价高的一抗 一抗 / 二抗浓度太高 降低一抗 / 二抗浓度 封闭不完全 增加蛋白封闭时间 洗涤不充分 增加冲洗次数与时间 可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景 信号弱或无信号 无目的蛋白或表达量极少 选用表达量高的细胞或组织 细胞通透性差 增加通透剂的作用时间或浓度 一抗 / 二抗浓度太低 增大其浓度 二抗选择错误(种属不匹配) 选用与一抗... 实验指南及答疑 2017-09-01
程浩 Western Blot常见问题分析 问题 可能原因 解决方法 背景值高 膜没有均匀浸润 PVDF 膜转膜前用 100% 甲醇将膜完全浸湿,转膜前用缓冲液浸泡 10min 膜或者缓冲液污染 拿取膜与吸水纸时要戴手套,更换新鲜转膜缓冲液 封闭不充分 更换封闭液或延长封闭时间 抗体与封闭液出现交叉反应 检测一抗、二抗与封闭液是否有交叉反应 抗体浓度过高 做预实验检测确定一抗、二抗的最佳工作浓度 杂带多 一抗不是唯一特异的 制备单克隆抗体或... 实验指南及答疑 2017-09-01