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问题 |
可能原因 |
解决方法 |
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背景值高 |
膜没有均匀浸润 |
PVDF 膜转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿，转膜前用缓冲液浸泡10min |
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膜或者缓冲液污染 |
拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 |
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封闭不充分 |
更换封闭液或延长封闭时间 |
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抗体与封闭液出现交叉反应 |
检测一抗、二抗与封闭液是否有交叉反应 |
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抗体浓度过高 |
做预实验检测确定一抗、二抗的最佳工作浓度 |
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杂带多 |
一抗不是唯一特异的 |
制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点制备抗体 |
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二抗出现非特异性结合 |
设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异性结合 |
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不同的剪接体 |
选取抗原特异区域进行免疫 |
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无信号或信号弱 |
抗体不适合于WB |
设置阳性对照和内参蛋白 |
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抗体浓度太低 |
加大抗体浓度 |
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抗体保存不当 |
分装保存，避免反复冻融 |
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抗原不充足 |
增加蛋白上样量 |
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膜漂洗过度 |
减少漂洗的时间和次数 |
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转膜不充分 |
延长转膜时间或增大转膜电压 |