小鼠调节性T细胞鉴定方案
本文介绍了小鼠调节性T细胞鉴定步骤,小鼠调节性T细胞鉴定所需流式抗体和辅助试剂等,提供了小鼠调节性T细胞完整鉴定方案,帮助客户轻松进行T细胞鉴定。

小鼠调节性T细胞鉴定步骤

小鼠Treg鉴定步骤

配色方案

细胞亚群

种属

指标

荧光标记

克隆号

Treg

Mouse

CD4

FITC

GK1.5

CD25

APC

PC-61.5.3

Foxp3

PE

3G3


小鼠调节性T细胞鉴定所需流式抗体

产品名称

荧光素

货号

规格

CD4

FITC

E-AB-F1097C

100T

CD25

APC

E-AB-F1102E

20T

Foxp3

PE

E-AB-F1238D

20T


小鼠调节性T细胞鉴定所需辅助试剂

作用

货号

名称

规格

同型对照

E-AB-F09822E

APC Rat IgG1,κ Isotype Control

20T

同型对照

E-AB-F09792D

PE Mouse IgG1, κ Isotype Control

20T

细胞染色缓冲液

E-CK-A107

Cell Staining Buffer

100mL

红细胞裂解液

E-CK-A105

10×ACK Lysis Buffer

100mL

固定破膜液

E-CK-A108

Foxp3/TranscriptionFactor Staining Kit

20 Assays


样本管设置

目的

样本

设置

调电压

1

Black(空白管)

调补偿

2

CD4-FITC

3

CD25-APC

4

Foxp3-PE

同型对照

5

CD4-FITC 、Foxp3-PE 、APC Rat IgG1, κ Isotype Control

6

CD4-FITC 、CD25-APC、PE Mouse IgG1, κ Isotype Control

Full Panel

7

CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE


实验步骤


一、小鼠脾细胞分离步骤:

1. 取小鼠脾脏,置于PBS中;

2. 可用注射器柱塞研磨脾脏,并通过70μm细胞过滤器过滤,收集滤液到15mL离心管;

3. 300g离心5min,弃上清,得到红色细胞沉淀;

4. 加2mL 1x 红细胞裂解液,重悬沉淀,室温下裂解2~3min,再加10mL PBS,终止裂解反应;

5. 300g离心5min,弃上清,得到白色细胞沉淀,用细胞染色缓冲液重悬细胞,并做细胞计数,调整细胞浓度为1×107/mL。


二、细胞固定破膜实验步骤:

(下面是全染管的实验步骤,空白组不加抗体,单染管只在对应步骤加对应流式抗体,同型对照组将相应的流式抗体替换成同型对照,所有组都要固定破膜)

1 .根据检测的量,稀释Foxp3检测专用的固定剂和破膜剂;

2. 取100μL小鼠脾脏细胞(1×106个细胞),置于流式管内,加入1Test的FITC Anti-Mouse CD4(E-AB-F1097C)和1Test的APC Anti-Mouse CD25(E-AB-F1102E)混匀,4℃孵育30min;

3. 孵育完毕后,加入1mL细胞染色缓冲液,300g离心5min,弃上清,再加入100μL细胞染色缓冲液,重悬细胞;

4. 加入1mL固定剂,涡旋混匀,4℃反应30min;反应完成后,600g离心5min,弃上清;

5. 加入2mL破膜剂,涡旋混匀,600g离心5min,弃上清;

6. 重复步骤 5;

7. 加入100μL破膜剂,重悬细胞,再加入PE Anti-Mouse Foxp3(E-AB-F1238D),混匀后室温孵育30min;

8. 加入2mL破膜剂,600g离心5min,弃上清;

9. 加入200μL细胞染色缓冲液,重悬细胞,即可上机检测。


实验结果

小鼠脾脏Treg细胞表型分析

                    小鼠脾脏Treg细胞表型分析

解析:

荧光素间有溢漏,故需要设置单阳管,用于调节补偿;

CD4分群明显,无需同型对照;CD25和Foxp3分群不明显,需同型对照;

本实验取正常小鼠脾脏验证,无生物学对照;

圈门路径:

   首先,根据FSC-A和SSC-A圈中目的细胞;

   其次,利用光散射特性,去黏连,得到单细胞;

   再次,通过CD4,确定CD4+辅助T细胞;

   最后,通过CD25+/Foxp3+,确定出Treg细胞亚群。



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