一直以来，很多老师在检测Th1/Th2/Th17等细胞的时候，都会有一个困扰，就是直接检测CD4的时候，细胞分群很好，但是为了检测细胞因子，需要用PMA刺激细胞后再检测CD4，刺激后的细胞就会发现CD4阴阳性细胞群分不开了。

出现这种现象的原因是什么呢？有哪些解决办法呢？今天我们一起来探讨吧！

                             PMA刺激前                                             PMA刺激后

                                    图1. PMA刺激前后人外周血CD4表达情况

其实，早在1990年就有学者发表文章揭示了PMA刺激对CD4表达的影响（Michael Bigby.  Phorbol myristate acetate-induced down-modulation of CD4 is dependent on calmodulin and intracellular calcium. The Journal of Immunlogy, 1990, 144:3111-3116 ）。

文章中展示了6种细胞的CD4表达情况，以及分别用5 ng/mL～500 ng/mL PMA刺激这些细胞后，CD4的表达变化。研究发现，Sub T1、 MOLT－3、人外周血淋巴细胞、小鼠胸腺细胞、AKR 1G1这五种细胞在PMA刺激后，CD4均出现明显内吞，但小鼠外周血淋巴细胞中CD4表达变化不明显。如图所示：

                                        图2. PMA刺激对CD4表达的影响

为了进一步搞清楚PMA刺激导致CD4内吞的机制，作者使用了钙调蛋白抑制剂W-7和三氟拉嗪，发现这两者在25 μM的终浓度能有效抑制PMA刺激导致的CD4内吞，说明钙离子在CD4的内吞中起了重要作用。如图所示：

图3. W-7或三氟拉嗪对PMA刺激导致的CD4内吞的影响

那么究竟是胞内钙离子还是胞外钙离子起着关键性作用呢？作者分别用了EGTA和QUIN-2两种钙离子螯合剂来测试。如图所示：

图4. 胞内及胞外钙离子对PMA刺激导致的CD4内吞的影响

EGTA可螯合胞外钙离子，QUIN-2 AM可结合胞内钙离子，从图中可以看出，经过QUIN-2 AM处理的细胞，因为缺少了胞内钙离子，PMA刺激导致的细胞CD4内吞的现象消失了，说明胞内钙离子在PMA刺激导致的CD4内吞中起到了重要作用。

通过以上实验结果以及我们经验，我们针对PMA刺激导致的CD4内吞，提供了几点解决方案供大家参考：

选择更亮的荧光标记或者结合效率更高的克隆号；

联合CD4和CD8进行圈门，使得圈出的CD4^＋T细胞更纯；

选择用钙离子螯合剂QUIN-2 AM处理阻止CD4下调，但需确保它不会影响其它指标的检测。

最近，针对Human CD4和Mouse CD4，我们分别新上线了对内吞影响小的克隆号SK3和RM4-5，系列详情见下表。

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