PMA刺激对CD4检测的影响及解决办法
在检测Th1/Th2/Th17等细胞的时候,常常会有一个困扰,就是直接检测CD4的时候,细胞分群很好,但是为了检测细胞因子,需要用PMA刺激细胞后再检测CD4,刺激后的细胞就会发现CD4阴阳性细胞群分不开了。为了解决这一难题,Elabscience分别新上线了对内吞影响小的克隆号为SK3和RM4-5的人CD4流式抗体。

一直以来,很多老师在检测Th1/Th2/Th17等细胞的时候,都会有一个困扰,就是直接检测CD4的时候,细胞分群很好,但是为了检测细胞因子,需要用PMA刺激细胞后再检测CD4,刺激后的细胞就会发现CD4阴阳性细胞群分不开了

出现这种现象的原因是什么呢?有哪些解决办法呢?今天我们一起来探讨吧!

PMA刺激前后人外周血CD4表达情况

                             PMA刺激前                                             PMA刺激后

                                    图1. PMA刺激前后人外周血CD4表达情况

其实,早在1990年就有学者发表文章揭示了PMA刺激对CD4表达的影响(Michael Bigby.  Phorbol myristate acetate-induced down-modulation of CD4 is dependent on calmodulin and intracellular calcium. The Journal of Immunlogy, 1990, 144:3111-3116 )。

文章中展示了6种细胞的CD4表达情况,以及分别用5 ng/mL~500 ng/mL PMA刺激这些细胞后,CD4的表达变化。研究发现,Sub T1、 MOLT-3、人外周血淋巴细胞、小鼠胸腺细胞、AKR 1G1这五种细胞在PMA刺激后,CD4均出现明显内吞,但小鼠外周血淋巴细胞中CD4表达变化不明显。如图所示:

PMA刺激对CD4表达的影响

                                        图2. PMA刺激对CD4表达的影响


为了进一步搞清楚PMA刺激导致CD4内吞的机制,作者使用了钙调蛋白抑制剂W-7和三氟拉嗪,发现这两者在25 μM的终浓度能有效抑制PMA刺激导致的CD4内吞,说明钙离子在CD4的内吞中起了重要作用。如图所示:

W-7或三氟拉嗪对PMA刺激导致的CD4内吞的影响

图3. W-7或三氟拉嗪对PMA刺激导致的CD4内吞的影响


那么究竟是胞内钙离子还是胞外钙离子起着关键性作用呢?作者分别用了EGTA和QUIN-2两种钙离子螯合剂来测试。如图所示:

胞内及胞外钙离子对PMA刺激导致的CD4内吞的影响

图4. 胞内及胞外钙离子对PMA刺激导致的CD4内吞的影响

EGTA可螯合胞外钙离子,QUIN-2 AM可结合胞内钙离子,从图中可以看出,经过QUIN-2 AM处理的细胞,因为缺少了胞内钙离子,PMA刺激导致的细胞CD4内吞的现象消失了,说明胞内钙离子在PMA刺激导致的CD4内吞中起到了重要作用。


通过以上实验结果以及我们经验,我们针对PMA刺激导致的CD4内吞,提供了几点解决方案供大家参考:

选择更亮的荧光标记或者结合效率更高的克隆号;

联合CD4和CD8进行圈门,使得圈出的CD4T细胞更纯;

选择用钙离子螯合剂QUIN-2 AM处理阻止CD4下调,但需确保它不会影响其它指标的检测。


最近,针对Human CD4和Mouse CD4,我们分别新上线了对内吞影响小的克隆号SK3和RM4-5,系列详情见下表。

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FcR简介及其对流式实验结果的影响
抗体是Y字形分子,分为Fab端和Fc端。Fab端是与目标分子特异性结合的区域,Fc端是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位。Fc受体(FcR)是免疫调节受体中非常重要的受体,主要在先天免疫细胞上表达,能识别并结合抗体的Fc端,引发免疫应答。