做流式的老师,肯定都对带荧光标记的流式抗体不陌生。在检测一些特殊的指标时,有时没有合适的荧光标记抗体,需要自己先标记抗体,再用带有荧光标记的抗体摸索抗体的应用方向。今天给大家带来荧光标记原理及影响荧光标记的因素介绍,让各位老师更加了解荧光标记实验,在做实验时能够更加得心应手。
一、荧光标记原理
抗体的化学本质是蛋白质,蛋白质是由氨基酸以脱水缩合的方式形成的。自然界中的氨基酸有几百种,但生物体内组成蛋白质的氨基酸只有约20种。氨基酸是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物,自然界的氨基酸多数含伯胺。氨基酸脱水缩合时,一个氨基酸分子的羧基(-COOH)和另一个氨基酸分子的氨基(-NH2)结合连接,同时脱去一分子水,这种结合方式叫做脱水缩合。经过脱水缩合,大部分氨基酸的伯氨基形成了酰胺键。氨基酸经过脱水缩合后,仍保留伯氨基的只有赖氨酸残基以及蛋白N末端的氨基酸。
![氨基酸脱水缩合示意图](http://files.elabscience.cn/assets/images/article/202407111627/img1.webp)
图1. 氨基酸脱水缩合示意图(图片来自网络)
荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物,受到合适的激发光照射时,可跃迁成为激发态,当从激发态恢复至基态时,发出荧光。利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上,可利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。
某些小分子荧光素或生物素等经过活化,在一定的pH及温度范围内,可以专一地与蛋白或者多肽上的伯胺基反应,形成稳定的酰胺键,从而实现标记物与蛋白或抗体的偶联。另外一些荧光素经过活化后,在一定条件下,可以与蛋白或抗体自身的,或额外引入的其他化学反应基团发生专一性反应,形成稳定的化学键,从而实现标记物与蛋白或抗体的偶联。
![荧光染料分子与蛋白或抗体连接示意图](http://files.elabscience.cn/assets/images/article/202407111627/img2.webp)
图2. 荧光染料分子与蛋白或抗体连接示意图
所以总结起来,荧光标记的原理是:活化的荧光素在一定的条件内,和蛋白或抗体上的活性基团发生反应,从而实现标记物与蛋白或抗体的偶联。荧光标记技术具有无放射物污染、操作简便等优点,这使得荧光标记的应用日趋广泛。
二、影响荧光标记的因素
无机盐组分干扰
蛋白质内含有干扰标记的组分,如甘氨酸、咪唑、Tris,叠氮化钠、硫柳汞、Proclin等,会影响最后标记效果,如果待标记的蛋白样本中含有上述成分,则需要在标记前通过透析、脱盐或多次超滤方式除去干扰标记的成分。
载体蛋白干扰
初始蛋白中含有载体蛋白如BSA、明胶等,有些蛋白保存过程中也会加入BSA作为蛋白质保护剂。这些载体蛋白也会和荧光素结合,从而影响标记过程中染料分子与目的蛋白的结合,因此如果待标记的蛋白样本中混有载体蛋白,则需要使用亲和纯化或其他色谱方法除去干扰成分,或者配合使用BSA去除试剂盒产品(货号:E-LK-R002),使用后准确定量蛋白质浓度再进行标记。
实验操作不恰当
如染料和蛋白未完全混匀,或其他误操作等,不恰当的操作同样影响最后的荧光标记结果,建议严格按照说明书操作流程进行标记。
初始蛋白浓度不准确
标记前,需要控制蛋白浓度,再根据公式进行计算染料使用量。若初始蛋白浓度不准确,则无法得到合适的染料使用量,容易出现标记不充分或过度标记的情况,从而影响之后的实验结果。
染料保存不恰当
部分染料易受潮水解失效,需要与干燥剂一同放置于-20°C或-80°C保存。为防止水蒸气冷凝到染料中,实验前将其移至室温平衡再进行后续操作。
三、Elabscience®标记相关产品(部分)
荧光染料
货号 | 产品名称 | 颜色 | 激光器(nm) | 最大激发波长(nm) | 最大发射波长(nm) |
E-FN-L103 | Red | 633 | 650 | 660 | |
E-FN-S102 | Yellow | 488/561 | 495, 565 | 575 | |
E-FN-S103 | Red | 633 | 650 | 660 | |
E-FN-S104 | Red | 488/561 | 495, 565 | 575 | |
E-FN-S101 | — | — | — | — |
标记试剂盒
产品名 | 颜色 | 规格 |
Elab Fluor®488标记试剂盒 | Green | 1/3/10 次标记 |
Elab Fluor®568标记试剂盒 | Orange | 1/3/10 次标记 |
Elab Fluor®647标记试剂盒 | Red | 1/3/10 次标记 |
Elab Fluor®680标记试剂盒 | Far-Red | 1/3/10 次标记 |
Elab Fluor®750标记试剂盒 | Infrared | 1/3/10 次标记 |
Elab Fluor®Red 780标记试剂盒 | Infrared | 1/3/10 次标记 |
Elab Fluor®Violet 450标记试剂盒 | Blue | 1/3/10 次标记 |
FITC 标记试剂盒 | Green | 1/3/10 次标记 |
发色生物素 标记试剂盒 | — | 1/3/10 次标记 |
生物素 标记试剂盒 | — | 1/3/10 次标记 |
本期荧光标记原理及影响标记的因素就介绍到这里,了解更多荧光染料及标记试剂盒及相关信息,请访问Elabscience官网 。