细胞核内因子染色流程
此为流式细胞核内染色步骤,用于细胞核内抗原染色实验过程参考,具体包括样本准备、细胞计数、设置实验分组、封闭Fc受体、细胞表面抗体孵育、固定破膜、细胞核内抗体孵育、上机操作等步骤。



一、样本准备

详见流式细胞术样本制备技术

1. 收集细胞,200目筛网过滤,收集滤液,300×g离心5 min,弃上清。

2. 向细胞中加入适量Cell Staining Buffer [E-CK-A107],用移液枪轻轻吹打细胞重悬。

二、细胞计数

用血球计数板或其他仪器对悬液进行计数后,调整细胞浓度约为1 × 107/mL。

三、设置实验分组

根据实验设计,设置实验分组,每管加入100 μL细胞悬液。

实验分组

作用

阴性/空白对照

调节仪器电压

单染/单阳对照

调节补偿

同型对照

消除背景染色

FMO对照

确定设门的准确性

生物学对照

实验结果对比

实验组

实验结果


四、封闭Fc受体

封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。

对于小鼠样本,纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合,封闭非特异性染色,使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5~1 μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体(E-AB-F0997A),室温孵育10min。

对于大鼠样本,可使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断,或者用商业化的Fc受体阻断剂

对于人样本,纯化的CD16单抗可作为封闭FCR封闭剂。加1 μg纯的抗人CD16单克隆抗体(E-AB-F1236A),室温孵育10 min。

五、细胞表面抗体孵育

根据实验设计,除空白对照外,对应的单染管、全染管加入相应的抗体5 μL,混匀,4℃避光孵育30 min。

六、固定破膜(如果做胞内因子的检测,请参照胞内因子染色流程

1. 按照说明书稀释固定破膜液(推荐使用Elascience® Foxp3/转录因子染色固定&破膜试剂盒E-CK-A108)。

2. 每管加入1 mL Cell Staining Buffer [E-CK-A107],300×g离心5 min,弃上清。

3. 加入100 μL Cell Staining Buffer [E-CK-A107],重悬细胞。

4. 每管加入1 mL的1× Fixation Working Solution,轻柔混匀,4℃避光孵育30 min。

5. 600×g离心5 min,弃上清。

6. 每管加入2 mL的1×Permeabilization Working Solution,轻柔混匀。

7. 600×g离心5 min,弃上清。

8. 重复(6)、(7)步一次。

七、抗体孵育

1. 加入100 μL 的1×Permeabilization Working Solution,重悬细胞。

2. 对应的单染管、全染管加入相应的抗体5 μL,混匀。

3. 室温避光孵育30 min。

4. 加入1×Permeabilization Working Solution,重悬细胞。

5. 600×g离心5 min,弃上清。

八、上机检测

1. 加入200 μL Cell Staining Buffer [E-CK-A107],重悬细胞。

2. 调整仪器参数,上机检测。

流式配色基本原则
对于大多数新手来说,流式细胞实验前的指标选择和配色是大家关注的重点,通过文献知道自己要做什么指标,但不理解文献里面为什么要这样配色,是基于什么原因来做配色方案的?本文介绍了流式配色基本原则,帮助大家更好理解配色。