一、样本准备
1. 收集细胞，200目筛网过滤，收集滤液，300×g离心5 min，弃上清。
2. 向细胞中加入适量Cell Staining Buffer [E-CK-A107]，用移液枪轻轻吹打细胞重悬。
二、细胞计数
用血球计数板或其他仪器对悬液进行计数后，调整细胞浓度约为1 × 107/mL。
三、设置实验分组
根据实验设计，设置实验分组，每管加入100 μL细胞悬液。
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实验分组 |
作用 |
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阴性/空白对照 |
调节仪器电压 |
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单染/单阳对照 |
调节补偿 |
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同型对照 |
消除背景染色 |
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FMO对照 |
确定设门的准确性 |
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生物学对照 |
实验结果对比 |
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实验组 |
实验结果 |
四、封闭Fc受体
封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。
对于小鼠样本，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5~1 μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体（E-AB-F0997A），室温孵育10min。
对于大鼠样本，可使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。
对于人样本，纯化的CD16单抗可作为封闭FCR封闭剂。加1 μg纯的抗人CD16单克隆抗体（E-AB-F1236A），室温孵育10 min。
五、细胞表面抗体孵育
根据实验设计，除空白对照外，对应的单染管、全染管加入相应的抗体5 μL，混匀，4℃避光孵育30 min。
六、固定破膜（如果做胞内因子的检测，请参照胞内因子染色流程）
1. 按照说明书稀释固定破膜液（推荐使用Elascience® Foxp3/转录因子染色固定&破膜试剂盒E-CK-A108）。
2. 每管加入1 mL Cell Staining Buffer [E-CK-A107]，300×g离心5 min，弃上清。
3. 加入100 μL Cell Staining Buffer [E-CK-A107]，重悬细胞。
4. 每管加入1 mL的1× Fixation Working Solution，轻柔混匀，4℃避光孵育30 min。
5. 600×g离心5 min，弃上清。
6. 每管加入2 mL的1×Permeabilization Working Solution，轻柔混匀。
7. 600×g离心5 min，弃上清。
8. 重复（6）、（7）步一次。
七、抗体孵育
1. 加入100 μL 的1×Permeabilization Working Solution，重悬细胞。
2. 对应的单染管、全染管加入相应的抗体5 μL，混匀。
3. 室温避光孵育30 min。
4. 加入1×Permeabilization Working Solution，重悬细胞。
5. 600×g离心5 min，弃上清。
八、上机检测
1. 加入200 μL Cell Staining Buffer [E-CK-A107]，重悬细胞。
2. 调整仪器参数，上机检测。