前段时间，我们发布了文章ELISA标曲异常的原因及对策（上）（点击查看），今天继续跟大家分享在实验过程中遇到的ELISA标曲异常的相关案例，并详细解释其原因和对策，助力大家顺利开展实验。
例5：显色正常，OD无法读值
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标准品浓度 （pg/mL） |
OD |
|
|
1000 |
2.579 |
2.397 |
|
|
500 |
1.835 |
1.786 |
|
|
250 |
1.161 |
1.244 |
|
|
125 |
0.657 |
0.704 |
|
|
62.5 |
0.176 |
0.141 |
|
|
31.25 |
0.000 |
0.000 |
|
|
15.625 |
0.000 |
0.000 |
|
|
0 |
0.000 |
0.000 |
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部分孔有肉眼可见的显色，却没有对应吸光值，可能是酶标仪检测波长没有设置到450nm或滤光片老化。建议确认波长或更换仪器进行检测。
例6：标准品浓度与吸光值呈反比
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标准品浓度 （pg/mL） |
OD |
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1000 |
0.387 |
0.375 |
|
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500 |
0.503 |
0.508 |
|
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250 |
0.699 |
0.692 |
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125 |
0.988 |
0.990 |
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62.5 |
1.336 |
1.325 |
|
|
31.25 |
1.668 |
1.674 |
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15.625 |
1.919 |
1.913 |
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|
0 |
2.265 |
2.258 |
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竞争法是酶标抗原和标准品/样品中的抗原竞争性地结合抗体，样本中抗原浓度与吸光值呈现反比，这是正常情况哦~
例7：跳/花孔
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标准品浓度 （pg/mL） |
OD |
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1000 |
2.401 |
1.837 |
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500 |
2.298 |
2.889 |
|
|
250 |
2.974 |
2.713 |
|
|
125 |
2.299 |
2.171 |
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62.5 |
1.601 |
0.466 |
|
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31.25 |
0.232 |
0.499 |
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15.625 |
0.116 |
0.092 |
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0 |
0.061 |
0.053 |
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一般是上样时液体溅出、枪头触壁划伤包被抗原、甩板时液体反溅、洗板时液体溢出、拍板时在同一地方反复拍板造成的。建议避免以上情况，重新进行实验。
例8：复孔CV大
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标准品浓度 （pg/mL） |
OD值 |
平均OD值 |
标准偏差SD |
变异系数CV |
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1000 |
3.401 |
2.732 |
3.067 |
0.473 |
15.43% |
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500 |
2.298 |
2.189 |
2.244 |
0.077 |
3.44% |
|
250 |
2.074 |
1.713 |
1.894 |
0.255 |
13.48% |
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125 |
1.195 |
1.051 |
1.123 |
0.101 |
9.04% |
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62.5 |
1.001 |
0.466 |
0.734 |
0.378 |
51.57% |
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31.25 |
0.232 |
0.399 |
0.316 |
0.118 |
37.43% |
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15.625 |
0.116 |
0.092 |
0.104 |
0.017 |
16.32% |
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0 |
0.061 |
0.053 |
0.057 |
0.006 |
9.92% |
可能原因
1) 液体量取体积不一致，使用前未混匀离心取上清；
2) 边缘效应：恒温箱温度并不完全恒温，可能会由于贴近箱壁，导致部分板条温度稍高；
3) 酶标板中液体有气泡，气泡会阻碍孵育时抗原抗体结合，读数时有气泡，会改变液体透光率；上机读数时，酶标板底有指纹或液体；
4) 酶标仪未提前开机预热，读值不稳定。
建议：
01 标准品加样时，可以单枪头从低浓度到高浓度垂直悬空添加，不换枪头，避免枪头误差；
02 孵育时，酶标板请勿堆叠，或放在贴近出风口和箱壁处；
03 离心管中有气泡，可通过低速离心去除；采用反向移液，枪头在液面下第二挡吸入液体，第一挡推出液体，适用于有一定粘度和有泡沫的液体操作；
04 酶标仪提前15分钟预热；上机读数前使用无尘布轻轻擦净板底。
例9：Origin拟合异常
使用Origin拟合标曲时，发现Fit Status显示Failed，因为标曲线性做到＞0.999，越接近1，说明线性特征越明显， XY关系已经无限趋近于直线关系，可以继续使用该标曲~
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