程浩 免疫印迹实验相关原理介绍 免疫印迹(Western blot)简介和原理 免疫印迹用于鉴定能够与特异性抗体相互作用的大分子抗原(一般为蛋白质)并测定抗原的大小。蛋白质首先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,再通过电泳转移到固相支持物上,固相支持物包括硝酸纤维素膜,聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和阳离子尼龙膜等。首先把膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附,这样固定的蛋白即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用。最后通过... 实验指南及答疑 2017-09-01
程浩 IHC原理、操作及注意事项 免疫组织化学 ( Immunohistochemistry , IHC ) 是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的一项技术。 IHC的实验流程和方法总体不难,但做出漂亮的染色结果却不容易,所谓“细节决定成败”,也正是IHC实验中尤为重要的关键点。那么“细节”主要是哪一些呢?... 实验指南及答疑 2017-09-01
程浩 IHC常见问题分析及处理 问题 原因 建议 结果中显色过深 一抗浓度过高或孵育时间过长 降低一抗浓度或减少孵育时间 孵育温度过高 室温或 4 ℃孵育 HRP 标记二抗孵育时间过长 缩短时间 IHC 结果中非特异性显色 石蜡切片脱蜡不彻底 延长脱蜡时间 操作过程中冲洗不充分 增加冲洗的次数与冲洗时间 组织富含内源性的生物素与过氧化物酶 使用相关试剂进行封闭 发生抗原异位 蛋白封闭不充分 增加蛋白封闭时间 IHC 结果中显色强... 实验指南及答疑 2017-09-01
程浩 缓冲液配制指南 Buffer配方 1.0 mol/L TrisHCl(pH 6.8) Tris 30.28 g 超纯水 200 mL 溶解后,用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250 mL,高温灭菌后室温下保存。 1.5mol/L TrisHCl(pH 8.8) Tris 45.43 g 超纯水 200 mL 溶解后,用浓盐酸调pH至8.8,最后用超纯水定容至250mL,高温灭菌后室温下保存。 10% S... 实验指南及答疑 2017-09-01
程浩 Western实验步骤 样本准备 1. 蛋白提取 所需仪器:匀浆器、RIPA裂解液、PMSF(蛋白酶抑制剂)、磷酸酶抑制剂、剪刀、镊子,消毒酒精棉、PBS、移液器、离心机。 裂解液配制——RIPA裂解液:PMSF=100:1。 1) 组织处理: 首先用酒精棉消毒剪刀和镊子,取适量的组织于匀浆器中,用剪刀剪碎加适量的裂解液冰水中匀浆1-4 min。匀浆结束后吸取溶液于EP管中保存备用。(含血液较多的组织可先用PBS清洗后再... 实验指南及答疑 2017-09-01