细胞功能|流式TUNEL常见异常结果分析
流式TUNEL是检测细胞凋亡最常用的方法之一。在进行流式TUNEL实验时,可能会遇到染色结果异常的问题,包括凋亡诱导组未检测到凋亡细胞群、细胞碎片较多、正常组阳性率高等,本篇整理了流式TUNEL常见问题分析。

流式TUNEL法使得大规模、快速、准确地定量分析细胞凋亡成为可能。然而,在实际操作过程中,大家可能会遇到一系列问题,今天就带大家来进行流式TUNEL异常结果分析

细胞在发生凋亡时会激活一些DNA内切酶,这些内切酶可以使染色体DNA双链或者单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端,细胞经过固定破膜后,TdT酶(脱氧核糖核酸末端转移酶)将荧光标记的dUTP连接到因DNA断裂而暴露的3'-OH末端,通过流式细胞仪检测dUTP偶联物发出的荧光信号,从而来检测晚期凋亡。

原位TUNEL相比,流式TUNEL灵敏度高,操作简单,能进行定性定量分析,尤其对于贴壁细胞来说,流式TUNEL可以收集到细胞上清中的晚凋细胞进行检测,结果更准确,因此,流式TUNEL成为了检测细胞凋亡最常用的方法之一。




流式TUNEL染色步骤


首先我们要了解一下流式TUNEL染色步骤:


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流式TUNEL分组设置


此外,还需要做一些分组设置:

分组

分组设置

目的

阴性对照(必做)

不加TdT酶,其余操作和实验组相同

①实验组的阴性设门参照

②排除由于细胞本底、细胞自身凋亡及操作过程等原因产生的背景荧光的影响

实验组(必做)

除了阳性对照和阴性对照,待检测的所有样本均是实验组

待检测的各实验组

阳性对照(选做)

用DNase酶处理或者用常用有效药物诱导细胞凋亡

用来验证本次实验操作和试剂盒有无问题




流式TUNEL异常结果分析


在进行流式TUNEL实验时,大家可能会遇到染色结果异常的问题,包括凋亡诱导组未检测到凋亡细胞群细胞碎片较多正常组阳性率高等,今天带大家来逐个击破。


01


凋亡诱导组未检测到凋亡细胞群

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异常原因

解决方案

细胞诱导凋亡失败

设置不同药物浓度梯度和诱导时间,找到合适的诱导条件

细胞数目较多,细胞破膜不彻底

增加Permeabilization Buffer的剂量,合理充分破膜

洗涤液中含有EDTA等螯合剂,导致TdT酶失效

使用不含EDTA的PBS洗涤

检测时间过长导致荧光淬灭

标记完的细胞1 h内尽快上机检测

细胞数目较少或者细胞沉淀导致采集到的信号较弱

放置过久的样本上机前先混匀后检测

标记时间过短

一般37°C孵育60 min

检测通道选错

选择正确的检测通道


02


细胞碎片较多

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异常原因

解决方案

固定不充分,破膜导致细胞破碎

适当延长固定的时间,充分固定细胞后再破膜

破膜时间过久,破膜温度过高

破膜时间应控制在10 min左右,最长不超过15 min,并于冰上破膜

细胞样本收集后未及时固定导致细胞状态变差

样本及时使用固定液室温固定1 h,离心洗涤后PBS(含1%BSA)重悬,4℃保存,3天内检测


03


正常组阳性率高

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异常原因

解决方案

非凋亡引起的阳性率升高,如坏死细胞、退化的细胞、正在经历 DNA 修复的细胞、被机械力破坏的细胞、高速分裂和增殖的细胞

配合其他的检测手段进行关联分析,如测定细胞的增殖速率,选定最佳的检测时期

标记时间过长导致非特异性背景增加

标记工作液现配现用,标记条件37℃ 60 min

细胞培养密度过高,接触抑制导致细胞死亡

调整适宜的细胞培养密度,检测当天细胞密度一般不超过培养皿的80%



以上就是为大家整理的流式TUNEL常见问题分析

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