树突状细胞（Dendritic Cells, DC）来源于骨髓，是功能最强大的抗原递呈细胞，在先天免疫和后天免疫系统之间起着通道的作用。DC细胞是唯一能够显著刺激初始T细胞（NAIVE T细胞）增殖的APC（Antigen Presenting Cells，抗原呈递细胞），其他APC（如B细胞和单核巨噬细胞等）仅能刺激已活化的效应T细胞或记忆T细胞。DC细胞是机体T细胞适应性免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中发挥着重要的作用。
虽然DC存在于体内多种组织中，但含量很少，无法满足科研和临床治疗的需求，需要在体外培养和扩增DC。对于小鼠，常用的方法是从骨髓细胞诱导获得DC，即骨髓来源的DC（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC）。
常见的小鼠BMDC制备方法有Sons法、Lutz法、Inaba法（改良），但培养过程复杂，需要多条件反复测试验证才能保证细胞得率和纯度。Mouse Bone Marrow-derived Dendritic Cells (BMDC) Differentiation and Culture Kit含有小鼠骨髓细胞DC分化培养试剂和DC促成熟试剂，提供了一套操作简便的BMDC分化培养和鉴定方案，使BMDC细胞的获得更便捷，主要流程包含以下内容：
图1. BMDC分化培养和鉴定流程
1
试剂准备和样本准备
01
BMDC全培养基的配制
在RPMI 1640基础培养基中（PM150114，Pricella®），加入终浓度为2 mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液、终浓度为100 U/mL的青霉素溶液、终浓度为100 μg/mL的链霉素溶液和终浓度为10%的特优级胎牛血清，配制好后4℃分装保存，1个月内使用完毕。
02
BMDC分化培养基的配制
使用BMDC全培养基稀释Mouse DC cell Differentiation MIX(1000X)到1X，即50 mL BMDC全培养基中加入50 μL Mouse DC cell Differentiation MIX(1000X)，轻轻吹打混匀。配制好后4℃保存，2周内使用完毕。
03
BMDC成熟培养基的配制
使用BMDC全培养基稀释Mouse DC Cell Maturation MIX(1000X)到1X，即50 mL BMDC全培养基中加入50 μL Mouse DC Cell Maturation MIX(1000X)，轻轻吹打混匀，即为BMDC成熟培养基。配制好后4℃保存，2周内使用完毕。
04
1X ACK Lysis Buffer的配制
取出4℃预冷的10X ACK Lysis Buffer（预先使用0.22 μM滤膜过滤除菌）和无菌去离子水，每900 μL无菌去离子水中加入100 μL 10X ACK Lysis Buffer，轻轻吹打混匀。配好的1X ACK Lysis Buffer 4℃预冷保存，24h内使用完毕。
05
小鼠骨髓细胞单细胞悬液制备
无菌环境制备小鼠骨髓细胞单细胞悬液。
2
BMDC的分化培养
01
第0天
使用BMDC分化培养基调整细胞密度到5×105cells/mL后，接种细胞到培养皿中，于 37℃ 5% CO2培养箱培养。
02
第1天
每皿细胞补加二分之一体积的BMDC分化培养基，轻轻晃动培养皿混匀，镜下观察细胞状态并拍照。
03
第3天
收集悬浮及疏松贴壁的细胞，150 g离心3 min，小心弃去上清。使用BMDC分化培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度到5×105cells/mL，接种细胞到新的培养皿中，于 37℃ 5% CO2 培养箱继续扩增培养。
04
第 5天
收集悬浮及疏松贴壁的细胞，细胞计数后，150 g离心3 min，小心弃去上清。使用BMDC分化培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度到5×105cells/mL，接种细胞到新的培养皿中，于 37℃ 5% CO2 培养箱继续扩增培养或进行下游实验。
05
第 5~7 天
细胞培养至第 5~7 天已形成不成熟的DC细胞，可根据实验目的，收集细胞进行计数，进入下游实验或继续诱导成熟。
注：在第5~7天的细胞扩增培养期，细胞增殖很快。若需继续培养，可观察细胞培养密度和状态。若培养基变色明显，细胞聚团较多，可每24 h补充二分之一体积的分化培养基，每48 h全换液，为细胞增殖提供充分的营养和生长环境，延长培养时间有利于增加DC细胞的纯度，DC细胞纯度可达70~80%。
3
BMDC的成熟培养
01
收集培养第5~7天的悬浮及疏松贴壁的细胞，细胞计数后，150 g离心3 min，小心弃去上清。使用BMDC成熟培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度到5~8×105cells/mL，接种细胞到新的细胞培养皿中，于 37℃ 5% CO2培养箱继续培养24 h。
02
收集悬浮细胞及疏松贴壁的细胞（此时为成熟的DC细胞），计数，进行表型鉴定或进入下游实验。
4
BMDC的鉴定
收集未成熟或成熟的DC细胞，加入流式抗体进行检测。
图2. 未成熟DC（左）细胞有少量树枝状突起，细胞聚团较少；成熟的DC细胞（右）树枝状突起增多，细胞聚团较多。
图3. 7 周龄雄性 C57/BL6 小鼠，骨髓细胞分化培养7天和7天分化后促成熟培养1天的流式对比检测图。
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相关鉴定抗体和试剂
产品名称 | 货号 | 厂家 |
Mouse DC Cell Differentiation MIX(1000X) | XJM003A | Elabscience |
Mouse DC Cell Maturation MIX(1000X) | XJM003B | Elabscience |
E-AB-F0990F | Elabscience | |
E-AB-F0991L | Elabscience | |
E-AB-F0992H | Elabscience | |
E-AB-F0994D | Elabscience | |
E-AB-F1028E | Elabscience | |
E-AB-F09842F | Elabscience | |
E-AB-F09853L | Elabscience | |
E-AB-F09852H | Elabscience | |
E-AB-F09832D | Elabscience | |
E-AB-F09832E | Elabscience | |
E-AB-F0997A | Elabscience | |
E-CK-A105 | Elabscience | |
E-CK-A107 | Elabscience | |
PM150110 | Pricella | |
PB180419 | Pricella | |
PB180120 | Pricella | |
164210 | Pricella |
XJM003A、XJM003B暂未上线，其他产品可点击货号查看详情。
以上就是小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养和鉴定过程，包括细胞的分化、成熟以及流式细胞术的鉴定方法。通过这些步骤，科研人员可以高效地获得高纯度的BMDC，为肿瘤免疫研究和临床应用提供重要的实验基础。希望本文能为您提供实用的指导和参考。更多流式干货，请持续关注流式课堂专栏！