Th1/Th2/Th17细胞简介及指标选择
Th1/Th2/Th17和Treg细胞是流式实验中常见的T细胞检测对象,本文主要对Th1/Th2/Th17细胞进行简要介绍,并讲解其检测指标及实例分析。

Th1/Th2/Th17和Treg细胞是流式实验中常见的T细胞检测对象,今天来给大家做一个Th1/Th2/Th17细胞的简要介绍,并讲解其检测指标及实例分析。

Th细胞分类示意图

                                                                         图1.Th细胞分类示意图 (图片来源于《医学免疫学》)


Th细胞,又称辅助性T细胞(helper T cell),主要通过不同亚群及相互作用,来活化巨噬细胞和其他免疫细胞以吞噬和清除抗原。Th细胞可以分泌多种细胞因子,参与人体内的各种免疫反应。Th1/Th2/Th17细胞均属于Th细胞,均表达CD4+,因此又都被称为CD4+T细胞。


Th1/Th2/Th17细胞介绍

 Th1细胞

Th1细胞主要分泌Th1型细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-2,这些细胞因子能促进Th细胞的进一步增殖,进而发生细胞免疫的效应。Th1细胞可通过分泌的细胞因子增强细胞介导的抗感染免疫。

Th2细胞

Th2可分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等细胞因子,这些细胞因子能促进Th2细胞的增殖,进而辅助B细胞活化,从而促进B细胞的增殖、分化和抗体的生成,发挥体液免疫的作用。同时,这些细胞因子可抑制Th1细胞增殖。

Th1/Th2细胞及其分泌的细胞因子

              图2.Th1/Th2细胞及其分泌的细胞因子 (图片来源于图虫创意)

                                                        

Th17细胞

Th17细胞通过分泌IL-17(包括IL-17A到IL-17F)、IL-21、IL-22、IL-26、TNF-α等多种细胞因子参与固有免疫和某些炎症的发生,在免疫病理损伤,特别是自身免疫病的发生和发展中起重要作用。

Th17细胞的分化及功能

                        图3.Th17细胞的分化及功能

(图片来源于Wu B , Zhang S , Guo Z , et al. The TGF-beta superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation[J]. Immunity, 2021(2):54.)


Th1/Th2/Th17细胞检测指标选择

要检测Th1/Th2/Th17细胞,应当如何选择指标呢?根据过往的实验经验,为大家进行了总结:

表1. Human样本Th1/Th2/Th17细胞检测

细胞

亚群

细胞因子标志

表面标志物

核内

标志物

Th1

IFN-γ

CXCR3+

T-bet

Th2

IL-4

CCR4+CCR6-CCR10-

GATA3

Th17

IL-17A

CCR4+CCR6+CCR10-

RORγt


表2. Mouse样本Th1/Th2/Th17细胞检测

细胞亚群

检测指标

Th1

IFN-γ

Th2

IL-4

Th17

IL-17A


Th1/Th2/Th17细胞检测,大多数文献显示,科研工作者主要选择其所分泌的细胞因子作为指标,也有部分老师会根据自身实验情况,使用对应细胞亚群的表面标志物或核内标志物进行检测。

另外,需要注意的一点是,选择IFN-γ、IL-4和IL-17A等细胞因子作为检测指标时,需要进行刺激阻断E-CK-A091)和固定破膜E-CK-A109),这样才能通过流式细胞仪检测到截留在胞内的细胞因子。


检测实例

下面向大家展示一下实际应用细胞因子进行Th1/Th2/Th17的检测案例,方便大家参考。

 人外周血PBMC Th1/Th2(4色)检测

Panel设置:

目的

样本

设置

调电压

1

Blank(空白管)

调补偿

2

CD3- PerCP/Cyanine5.5

3

CD4- FITC

4

IFN-γ-APC

5

IL-4- PE

APC-FMO联合同型对照划门

6

CD3- PerCP/Cyanine5.5、CD4- FITC、

IL-4- PE、Mouse IgG1,

κ Isotype Control- APC

PE-FMO联合同型对照划门

7

CD3- PerCP/Cyanine5.5、CD4- FITC、

IFN-γ- APC、Rat IgG1,

κ Isotype Control-PE

Full Panel

8

CD3- PerCP/Cyanine5.5、CD4- FITC、

IFN-γ- APC、IL-4- PE

流式抗体信息:

指标

荧光标记

克隆号

货号

CD3

PerCP/Cyanine5.5

OKT3

E-AB-F1001J

CD4

FITC

SK3

E-AB-F1352C

IFN-γ

APC

B27

E-AB-F1196E

IL-4

PE

MP4-25D2

E-AB-F1203D

Mouse IgG1, κ Isotype Control

APC

MOPC-21

E-AB-F09792E

Rat IgG1, κ Isotype Control

PE

HRPN

E-AB-F09822D

检测结果:

人外周血PBMC Th1/Th2(4色)检测

如上图所示,首先根据FSC/SSC确定PBMC细胞进行圈门,去除粘连体后,利用CD3+圈出T淋巴细胞群;再分别根据IFN-γ和CD4+圈出Th1细胞群、IL-4和CD4+圈出Th2细胞群,即可完成检测。


人外周血PBMC Th17(3色)检测

Panel设置:

目的

样本

设置

调电压

1

Blank(空白管)

调补偿

2

CD3- PerCP/Cyanine5.5

3

CD4- FITC

4

IL-17A-PE

PE-FMO联合同型对照划门

5

CD3- PerCP/Cyanine5.5、CD4- FITC、Mouse IgG1, κ Isotype Control-PE

Full Panel

6

CD3- PerCP/Cyanine5.5、CD4- FITC、IL-17A- PE


流式抗体信息:

指标

荧光标记

克隆号

货号

CD3

PerCP/Cyanine5.5

OKT3

E-AB-F1001J

CD4

FITC

SK3

E-AB-F1352C

IL-17A

PE

BL168

E-AB-F1173D

Mouse IgG1, κ Isotype Control

PE

MOPC-21

E-AB-F09792D


检测结果:

 人外周血PBMC Th17(3色)检测


如上图所示,根据FSC/SSC圈出PBMC细胞群,在去除粘连体之后,根据CD3+圈出T淋巴细胞群,再根据CD4+和IL-17A确定Th17细胞群。


注意:

▲PBMC分选后,需要先用细胞因子刺激阻断剂进行刺激阻断培养(本实验用到试剂为:细胞因子激活和蛋白阻断试剂盒E-CK-A091 );

▲PMA刺激会导致人T细胞表面CD4部分内吞,因此我们需要选用对内吞影响小的CD4克隆号抗体SK3;

▲IFN-γ、IL-4、IL-17A需要做同型对照,因为一般情况下细胞因子表达量不高;

▲破膜剂对细胞损伤较大,建议离心后形成的细胞沉淀先弹散成细胞悬液后再加入破膜剂,以减少细胞损伤。



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小鼠特有细胞Marker的选择
F4/80表达在小鼠巨噬细胞中,小鼠表面FcR通过Mouse CD16/32纯抗就能有效封闭,不同品种的小鼠,细胞鉴定时需要选择不同的指标