常见流式样本的保存方法及注意事项
流式细胞术在细胞计数、细胞抗原检测、细胞功能检测、细胞核酸性能分析等实验中发挥着重要作用,相比其他检测方法,具有目标精准、指标量化、节约样本、高通量等检测优势。流式样本制备及保存作为流式细胞术至关重要的一环,对实验的成败有着举足轻重的作用,本文将流式细胞术中常见的样本保存方法和注意事项做一个汇总。

流式细胞术在细胞计数、细胞抗原检测、细胞功能检测、细胞核酸性能分析等实验中发挥着重要作用,相比其他检测方法,具有目标精准、指标量化、节约样本、高通量等检测优势。

流式样本制备及保存作为流式细胞术至关重要的一环,对实验的成败有着举足轻重的作用,下面我们将流式细胞术中常见的样本保存方法和注意事项做一个汇总。

首先,流式细胞术常见的样本有以下几种

分类

特征

流体样本

骨髓、外周血、体液(胸水、腹水、脑脊液)

细胞为单细胞,需要加抗凝剂和裂解红细胞

体外培养传代的细胞系细胞

包含贴壁细胞和悬浮细胞

实体样本

非免疫系统组织:肝脏、心脏、肺脏、胃肠组织、脑组织等

细胞紧密连接,需要通过酶消化或者研磨制备单细胞悬液

免疫系统:胸腺、脾脏、淋巴结等

每种样本均具有各自的特性,现将常见样本的保存和处理方法汇总如下:

 流体样本的处理和保存

名称

处理方法

保存方法和时长

注意事项

应用

外周血样本

采集新鲜样本与抗凝剂充分混匀,注明样本采集日期和时间

室温:乙二胺四乙酸二钾可稳定保存12~24 h;枸橼酸葡萄糖液可稳定保存72 h;肝素钠抗凝剂可稳定保存48 h

若白细胞计数、白细胞分类与流式细胞术检测共用同一管样本,应选择乙二胺四乙酸二钾作为抗凝剂

血液疾病的免疫分型检测;白细胞计数;白细胞形态学染色和分类

骨髓样本

人骨髓样本:新鲜样本采集后置于肝素钠抗凝剂中

正常样本T细胞检测,室温肝素钠抗凝保存48 h;B细胞检测4℃保存72 h;单核及髓系表型检测4℃环境下可保存48 h;高分化淋巴瘤样本检测建议采集后立即检测

不宜采用其他抗凝剂,因骨髓穿刺液样本与枸橼酸葡萄糖液的比例不是最佳时易导致PH值的改变,从而降低细胞的活性

免疫系统疾病的表型分析;形态学染色分析

小鼠骨髓样本:1~2mL注射器吹打成单细胞悬液,裂解红细胞后,重悬于无菌RPMI培养液等组织培养介质中

活细胞:单细胞悬液使用染色缓冲液4℃可保存24 h;

固定细胞:采用4%的多聚甲醛溶液室温固定30 min,离心洗涤,1%甲醛的磷酸缓冲液重悬细胞沉淀,4℃保存1周

冰上裂解红细胞,红细胞裂解时长不超过1 min;固定后的细胞使用1%甲醛或多聚甲醛缓冲液重悬时,该缓冲液应现配现用

细胞分选;体外培养和扩增;免疫学相关研究;骨髓免疫细胞表型分析

胸水、腹水、脑脊液样本

标准化操作收集样本,胸水、腹水样本可选用肝素钠、乙二胺四乙酸二钾、枸橼酸葡萄糖液作为抗凝剂;脑脊液使用Transfix等培养基或转运基质

胸/腹水样本4℃环境下可保存24 h;脑脊液4℃可保存24~48 h

选用枸橼酸葡萄糖液抗凝剂过夜保存的样本细胞较弱、活性较低,注意其和抗凝剂保持合适比例;脑脊液不适用任何抗凝剂

免疫系统疾病的表型分析;形态学染色分析

体外培养的细胞系

悬浮细胞直接收集;

贴壁细胞酶消化后收集


立即检测,室温3 h内处理

针对不同的检测方法选用合适的缓冲液,避免一些金属离子的干扰

活细胞AnnexinV凋亡检测;细胞死活分析;细胞表型分析等

固定后保存:TUNEL流式固定液室温固定60 min后,离心洗涤,再使用90%FBS+10%DMSO冻存,可稳定保存2个月

细胞固定要充分;冻存细胞注意梯度降温

TUNEL流式检测;耐固定表型抗体检测等

固定后保存:70%冰乙醇-20℃固定保存1周

细胞沉淀使用PBS重悬,加入-20℃预冷的无水乙醇至终浓度为70%,加固定液的过程注意边加边混匀,避免细胞凝集聚团

细胞周期检测;DNA探针检测等

实体样本的处理和保存

名称

处理方法

保存方法和时长

注意事项

应用

肝脏、心脏、脾脏、肾脏、脑组织、肺脏、胃肠等硬度较小组织

筛网研磨法处理;酶消化法处理

活体组织:组织培养基浸泡,4℃可保存24~48 h;置于0.9%氯化钠溶液中,4℃环境下可保存24 h。

单细胞悬液:细胞沉淀使用HBSS缓冲液(含钙镁离子)或者全培养基重悬4℃可保存24 h;

固定细胞:制备成单细胞悬液后,采用4%的多聚甲醛溶液室温固定30 min,离心洗涤,1%甲醛的磷酸缓冲液重悬细胞沉淀,4℃保存1周

研磨组织注意筛网浸入培养基中,采用较软的乳胶棒或者注射器活塞端进行研磨,避免细胞物理损伤;酶消化法注意细胞勿消化过度;酶消化后及时加入HBSS缓冲液(含钙镁离子)进行终止消化和离心洗涤,含钙镁离子的缓冲液有助于维持细胞的活力

细胞分选;免疫细胞表性分析;免疫细胞细胞因子分泌功能检测等

淋巴结、软骨、实体肿瘤等硬度较大的组织

酶消化法

不易采用研磨法处理硬度较大的组织,会导致细胞破碎;酶消化法的注意事项同上

综上所述,不同的细胞和组织根据实验内容的不同,会有不同的处理方案和保存方法,需要根据具体问题和实验需求制定最优化的样本处理方案。

流式实验中常见组织样本单细胞悬液制备方案
众所周知,好的样本制备是实验成功的一半。单细胞是流式细胞术对细胞进行分析检测的前提条件。因此,在进行流式实验时,制备出合格、分散的单细胞悬液是流式细胞术样本制备技术中重要的一环,它既要求组织分散成为单个细胞,又要维持细胞的固有属性及生物学特性。今天,给大家列举几个常见流式组织样本单细胞悬液制备方案,助力流式实验。