小鼠肿瘤样本制备
1. 颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死,75%酒精浸泡5 min,取出小鼠置于无菌操作台上。
2. 左手持镊子,右手持弯剪,沿肿瘤边缘剪下长约1cm的口子,可清晰看见肿瘤附着于皮下,沿肿瘤边缘轻轻剪开连接处,剥离肿瘤。
3. 将剥离的肿瘤放入100 mm的培养皿中,并在室温下加入5~10 mL的1640基础培养基。
单细胞悬液的制备
A.混合酶消化法
1. 待所有肿瘤剥离完毕后,将肿瘤转移至1.5 mL EP管中,手持弯剪将肿瘤充分剪碎,边剪边加入1640基础培养基,静置数秒,使用1 mL移液器吸出上层较小颗粒,继续剪碎组织,重复加入1640基础培养基,直至所有的组织大小均符合要求。
2. 将肿瘤组织悬液转移至50 mL离心管中,加入1640基础培养基,250 g离心5 min,弃上清,加入4.5 mL的1640基础培养基,重悬细胞沉淀并转移至培养皿中。
3. 加入500 μL 的10×Triple Enzyme stock solution 混合酶溶液,轻轻吹打至充分混匀,转移至37℃水浴摇床消化孵育1~2 h。
4. 消化结束后用1640基础培养基或者PBS稀释,再用200目筛网,除去残留的组织块,并使用5~10倍体积的1640基础培养基或者PBS缓冲液洗涤一次,过滤至无组织块为止,获得单细胞悬液。
5. 收集细胞悬液,300 g离心5 min,弃上清。
6. 用细胞染色缓冲液重悬细胞,并调整细胞浓度至1×107/mL。
B. 研磨法
1. 提前准备好200目的一次性细胞筛网,用1640基础培养基或者PBS润湿并浸泡备用(浸泡放置于6 cm细胞培养皿或者6孔板)。
2. 将剥离的肿瘤组织转移到200目的细胞筛网,用无菌眼科剪剪成小颗粒。
3. 取2.5 mL注射器活塞,用软头打圈方式研磨组织,研磨至筛网上无明显的组织块为止,取新鲜的1640培养基或者PBS冲洗筛网2~3次。
4. 将获得的细胞悬液用200目细胞筛网过滤。
5. 收集细胞悬液,300 g离心5 min,弃上清。
6. 用细胞染色缓冲液重悬细胞,并调整细胞浓度至1×107/mL。
小鼠肿瘤细胞FSC/SSC图
小鼠肿瘤细胞CD45/SSC图
注意事项:
1. 肿瘤体积一般不超过1000 mm3,肿瘤质量在0.6~0.8 g之间。(若肿瘤较大下述各反应体系加倍)。
2. 酶消化法剪刀剪碎肿瘤的标准为,其可被1 mL的枪头自由吸取,无阻碍。
3. 酶消化法时要避免组织消化过度,需要每隔20 min取出观察,无明显组织块后即结束消化;细胞团块越小,消化越快,1 mL移液器可以吹打的组织块,约消化30~60 min即可完成;若组织难以剪切,也可以切成大小1~2 mm3左右大小,每30 min用1 mL的移液器吹打混匀一次,直至可以顺畅通过,约1~2小时可以充分消化。
4. 研磨时为尽量减少细胞损伤,需要浸泡于培养基中研磨,避免干磨。