程浩 HRP底物分类 底物范围较广,包括二氨基联苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。 二氨基联苯胺/金属盐 DAB是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。它产生强烈的棕色产物,在水和醇中不溶解。多数情况下,推荐在DAB中加入不同的金属离子。当加入金属盐如钴、镍至底物液中,辣根过氧化物酶可以更加敏感。此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色,且在水及醇中稳定。DAB/金属盐染色应用的组织染色范围较广。 1. 需要的溶液和特殊设备 DA... 实验指南及答疑 2017-09-02
程浩 ELISA实验操作要点 优质的试剂,良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异,国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点,珠式、管式及磁性球ELSIA,国外试剂均与特殊仪器配合应用,两者均有详细的使用说明,严格遵照规定操作,必能得出准确的结果。 1. 标本的采取和保存 可用作 ELISA测定的标本十分广泛,体液(如血清... 实验指南及答疑 2017-09-02
程浩 生物素亲和素ELISA系统介绍 生物素亲和素(又称抗生物素)系统(biotin avidin system,BAS)标记抗体的技术是20世纪70年代后期发展起来的一种新的免疫检测方法。由于亲和素与生物素间的亲和力极强,结合迅速,且极其稳定,生物素标记抗体和酶的标记率高,又不影响蛋白的活性,使BAS标记技术比常规酶联免疫、放射免疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度,为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。近年来,在BAS检测中多用链霉亲... 实验指南及答疑 2017-09-02
程浩 ELISA中的抗原与抗体的反应 抗体的结构 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类,即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为 IgG和IgM。Ig由两个轻链(L)和两个重链(H)的单体组成。Ig的轻链是相同的,有κ(kappa)和λ(Lambda)两种型别。五类Ig的重链结构不同,这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ(gamma)链... 实验指南及答疑 2017-09-02
程浩 ELISA原理与分类 一、ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量... 实验指南及答疑 2017-09-02
程浩 ELISA常见问题 问题描述 可能原因 相应对策 精确度低 洗涤不完全 保证洗板机正常运行 保证充足的浸泡时间 拍板不完全 充分拍板至孔内无明显残留液体 试剂混合不充分 保证溶液充分混合 溶液被污染 重新配制溶液 标准品稀释不正确 稀释液作为空白值;保证用最高浓度标准品精确稀释 保证按正确倍比梯度稀释 标准曲线梯度差 洗涤不完全 保证洗板机正常运行 拍板不完全 充分拍板至孔内无残留液体 每孔加液体积不等 检查移液器 ... 实验指南及答疑 2017-08-31
程浩 移液时的注意事项 移液的一致性是实验重复性好的关键。移液时必须保持平稳、一致的速度。吸液和加液时要避免突然挪动移液器。 1. 检查移液器枪头,确保其正确安装在移液器末端。 2. 加不同的试剂和样品时需更换枪头。 3. 加液的体积不能少于说明书上建议的体积,否则会降低实验的准确性和重复性。 4. 一些溶液可能容易吸附在枪头的内壁或外壁,用样本或试剂来润洗枪头可降低或避免液体的表面张力,从而提高实验的准确性。 5.针对... 实验指南及答疑 2017-08-31
程浩 如何清洗ELISA酶标板 正确地清洗酶标板是成功完成 ELISA 实验的关键之一。稀释浓缩洗涤液时应使用去离子水或蒸馏水。 以下是正确清洗酶标板的注意事项: 使用多通道移液器 首先,检查酶标板确保其牢固放置于板架上。随后,翻转酶标板倾倒液体。按照说明书所示体积在每孔加入洗涤液。按照推荐的时间,计时器设置洗涤液浸泡时间。再次翻转酶标板倒出液体,用干净的吸水纸轻拍,将孔内液体拍干。按照说明书建议的次数重复以上步骤。最后一次在吸... 实验指南及答疑 2017-08-30
程浩 如何提高ELISA的精确重现性 免疫检测法的精确性表现为单次实验孔间(批内)的重复性和多次实验之间(批间)的重复性。CV值高则表明精确度低,通常由以下两个原因造成:移液技术和洗涤技术。 移液技术 1. 移液时,枪头应对准孔中央,避免接触孔壁及底部。 2. 移液后轻轻晃动混匀试剂。 3. 如果您的样品具有黏性,请预先润洗枪头以消除表面张力的影响。吸液时等待片刻使体积平衡后再取出。 4. 移液不充分或移液体积不均,说明移液器需要校正... 实验指南及答疑 2017-08-30
程浩 ELISA提示 ELISA 实验失败可能由多种因素造成。在实验前阅读并充分了解产品说明书,可以一定程度上避免出现意想不到的结果。 参考以下提示来避免实验出现问题。 1. 检查试剂盒的保质 期,保 证所有试剂按说明书上的建议正确保存; 2. 检查试剂溶液是否存在不稳定或降解迹象,如沉淀或变色等; 3. 底物溶液应为无色; 4. 试剂制备和保存时应使用干净的一次性塑料吸量管、枪头和容器。每次加液(样品、标准品及其他试... 实验指南及答疑 2017-08-30
程浩 ELISA结果计算 作为ELISA的最后一步,检测结果的计算对整个实验十分重要。 以夹心法为例。 1. ELISA的样本通常要设置1~2个复孔进行检测,分别求出标准品、实验组样本的吸光度的平均值。单个样本的检测值不应超出平均值的20%。 2. 样本的OD(吸光度)平均值要减去标准品浓度为0时的OD平均值。 3. 建立标准曲线 在对数坐标图上拟合四参数的逻辑函数曲线(X轴上为标准品浓度,Y轴为对应的OD值)。推荐使用o... 实验指南及答疑 2016-01-22
程浩 夹心法ELISA操作步骤 实验开始前,各试剂和样本均应平衡至室温;样本复融后需再次离心,取上清检测;试剂或样本配制时,需充分混匀并尽量避免起泡;标曲和样本建议做复孔检测。 1. 加样 :将 标准品工作液 依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔100 μL。待测样品加入到其他孔,每孔100 μL(若样本浓度高于检测范围,需用 标准品&样本稀释液 稀释后取样)。给酶标板覆膜,37℃孵育90分钟。提示:加样时将样... 实验指南及答疑 2015-08-16