本文主要介绍ELISA试剂盒、实验样本、ELISA数据处理相关问题,帮助大家更好地开展实验
试剂盒
Q1:科研试剂盒与临床试剂盒的区别 ?
A1:临床试剂是经过权威机构认可的,如FDA、CFDA等;而科研试剂一般是厂家自主研制,不需要通过权威机构验证。
经营临床诊断类产品的机构需要取得《医疗器械经营企业许可证》;经营科研试剂的机构不需要此证件。
临床试剂盒一般仅用于检测人血清/血浆等较为单一的分泌性样本类型;科研试剂盒的样本检测种类、检测范围则比临床试剂盒宽广得多。但一般来说,临床试剂盒的质量、稳定性等性能会优于科研试剂盒。
Q2:ELISA试剂盒是否含有有毒有害成分?试剂盒安全性如何?
A2:我司提供的ELISA试剂盒,除添加BSA作为保护蛋白外,无任何其他动物来源成分,符合卡塔赫纳生物安全协议要求。此外,试剂盒防腐剂采用毒性较低的proclin 300,安全环保。
Q3:试剂盒能否分次使用?没有用完的试剂组分如何存放?
A3:试剂盒可以分次使用。我们的酶标板条是可拆卸的,您可以根据实验需求,确定每次实验所需的酶标板条数量及各试剂组分含量。
溶解后的标准品,建议以最高浓度/母液,分装保存于-20℃条件下,避免反复冻融,半个月内使用有效。
生物素化抗体工作液及HRP酶结合物工作液需现配现用。未用完的浓缩液及其他组分,需要按照说明书要求,分别及时地保存于2~8℃/-20℃条件下,一般可存放6个月。
样本
Q1:高脂实验样本该如何处理?
A1:高脂实验样本含有脂肪,不是均质溶液,若直接上样,会影响抗原抗体的结合,导致测值不准确。建议先大转速(5000×g)离心,静置10min后,取中层较澄清液体,再用大转速(≥5000×g)离心一次,取中下层清液,用于检测。
Q2:实验样本稀释方案是怎样的?
A2:试剂盒检测范围不等同于实验样本中待测物的浓度范围。实验前,建议通过相关文献预估实验样本中待测物的浓度,并通过预实验确定实验样本的实际浓度情况。
如果您的检测样本需要稀释,参考稀释方案如下:
稀释100倍:一步稀释。取5μL样本到495μL标准品&样本稀释液内,做100倍稀释;
稀释1000倍:两步稀释。取5μL样本到95μL标准品&样本稀释液内,做20倍稀释,再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品&样本稀释液内,做50倍稀释,总共稀释1000倍;
稀释100000倍:三步稀释。取5μL样本到195μL标准品&样本稀释液内,做40倍稀释,再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品&样本稀释液内,做50倍稀释,最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品&样本稀释液内,做50倍稀释,总共稀释100000倍;
每步稀释时,取液量不少于3μL,稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀。
Q3:大小鼠采血容量?
A3:根据实验方案所需采血量的要求,我们可以选择不同的采血方式。
鼠尾采血法:
取血量较少时,采用此方法。通常选择剪断尾巴进行采血。亦可不剪尾,用7-8号注射针头刺入尾静脉采血。
小鼠每次可取血0.1mL,大鼠每次可取血0.2~0.4mL,可多次反复采血。
眼眶静脉丛采血法:
取血量中等时,采用此方法。持玻璃毛细管,从眼内眦部以45°刺入眼眶静脉丛,进行采血。
小鼠每次可取血0.2~0.3mL,大鼠每次可取血0.4~0.6mL,可多次反复采血。
断头采血法:
取血量较多时,采用此方法。无需麻醉动物,快速剪掉头颈部,倒立动物,让血液自由滴入容器。
小鼠可取血0.8~1.2mL,大鼠可取血3.0~8.0mL,此方法为致死性采血。
数据处理
Q1:标准曲线使用的是什么拟合函数?可以用Excel来制作标曲吗?为什么我做出的标准曲线不是一条直线?
A1:推荐使用Origin软件,或者其他含有4-PL(四参数logistic)函数模型的软件去拟合得到标准曲线。4-PL拟合方式能够更精确地反映浓度和吸光度的线性关系,从而更准确地获得样品中待测物质的浓度值。Excel拟合方式一般为直线和多项式,这两种拟合方程均不推荐作为ELISA标曲的拟合方式。
Origin软件可点击此链接下载安装包:
https://special-a.oss-cn-qingdao.aliyuncs.com/Origin_9.1.zip
Q2:如何使用Origin绘制标准曲线&计算ELISA实验结果?
A2:ELISA实验的结果计算包括标准曲线拟合和样本浓度计算。计算标准品和样品复孔的平均OD值,并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在双对数坐标上拟合四参数的逻辑函数标准曲线,再将样本OD值代入标曲,即可得到样本浓度值。若样本测定前被稀释,则样本实际浓度需乘以稀释倍数。
Q3:说明书中的标曲可以直接用来计算吗?若实际标曲的OD值及图像与说明书上有差异,是什么原因导致的?
A3:说明书上的标曲是指示标曲,主要用于呈现拟合后标曲的形态,及最高/最低OD值的质控范围。由于受实验操作、实验环境及仪器参数设定等因素的影响,客户实际做出的标曲OD值可能会与说明书不一致(整体偏高或偏低)。这种情况下,建议在显色阶段控制前4个蓝色孔,使之呈现明显的颜色梯度。标曲的最大OD值在1.2以上,相关系数在0.99以上,即可作为有效标曲。
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