ELISA不同色彩背后,藏着哪些特殊秘密?
ELISA实验过程中,除了常见的蓝色和黄色,也会出现一些不同寻常的多样色彩,每种颜色背后,都有着特殊含义。本文将从ELISA的“外观”和“产出”两部分,解析藏在其中的色彩秘密。

ELISA又称酶联免疫吸附测定,自1971年问世至今,已成为定量检测体液中各种靶标蛋白含量的常用方法。

ELISA呈色反应可进行定性或定量分析,利用HRP酶催化TMB,反应产生蓝色亚胺溶液,加入终止液后,使蓝色阳离子转变为黄色的联苯醌。

辣根过氧化物酶催化氧化3,3',5,5' -四甲基联苯胺

图:辣根过氧化物酶催化氧化3,3',5,5' -四甲基联苯胺[1]

除了常见的蓝色和黄色,ELISA实验过程中,也会出现一些不同寻常的多样色彩。每种颜色背后,都有着特殊含义。

接下来,我们将从ELISA的“外观”和“产出”两部分,解析藏在其中的色彩秘密


一. 外观(组分)

01 · 粉红色

例1:为什么有的试剂盒内稀释液和浓缩生物素化抗体呈粉红色?

ELISA实验_粉红色

试剂盒的某些组分中,由于添加了特殊保护剂,会呈现红/粉色,例如QuicKey系列的酶结合物稀释液和E-EL-R0939的浓缩生物素化抗体。这种颜色的试剂性能正常,请按照说明书内操作要求放心使用。

02 · 黄色

例2:为什么稀释液呈淡黄色?


ELISA_淡黄色


稀释液中含有防腐剂,正常情况下是澄清透明无异味的液体。如果稀释液变得浑浊、发臭、并且产生沉淀,大概率是被细菌污染,不建议再使用。

03 · 色 / 黄绿色

例3:TMB底物溶液在使用前就变色?

 ELISA_蓝色 / 黄绿色


TMB底物溶液未避光保存、敞口时间过久,会被空气中的HRP酶氧化,呈浅蓝/蓝色。这种情况下直接使用,会导致假阳性结果。所以,变蓝的TMB溶液,就不建议再继续使用了哦~


二. 产出(结果)

01 · 墨绿色 / 深蓝色

例4:加入底物溶液孵育后,酶标板孔溶液变成墨绿色或深蓝色


ELISA_墨绿色 / 深蓝色


在正常的ELISA实验中,加入底物溶液孵育后,标曲前四孔出现明显蓝色梯度,即可终止反应。但是,当孵育的HRP酶结合物工作液浓度过高,或样本浓度远高于检测范围时,标曲最高1-2个梯度孔或样本孔可能会呈现墨绿色或深蓝色。

墨绿色样本终止反应后,在450nm波长下读取的OD值可能会比实际要低;深蓝色标曲会由于梯度OD值过于接近,无法拟合得到有效标曲并准确计算样本浓度。

建议:

(1)严格控制每一步的孵育温度和时间,按照说明书要求制备HRP酶结合物工作液;

(2)在显色阶段,通过前四孔出现明显蓝色梯度来控制显色时间;

(3)浓度过高的样本需要稀释到试剂盒检测范围内,再进行测定。

02 · 黄色

例5:终止反应后,整板变成黄色

 ELISA_整版变成黄色


可能原因:

1 竞争法按照夹心法操作:两者原理不同,操作步骤不同,请注意区分。

2 洗涤不当:甩板时离废液桶太近,导致液体反溅;甩板不干脆,导致液体残留或流入其他孔;洗涤时每孔注入的洗液不够,或洗涤次数不够;液体过多溢出污染;浸泡时间过短;

3 显色剂保存不当,或孵育时未避光,造成非特异性显色;

4 孵育温度过高,或孵育时间过长;

5 不同试剂盒组分混用或替代,产生基质效应或非特异性吸附,导致假阳性结果。

例6:标曲正常,样本孔全黄

ELISA_标曲正常,样本孔全黄


读值计算后,发现标曲拟合效果良好,但样本OD超过标曲最大OD,表明样本还需要稀释哦。

03 · 黑色

例7:加入终止液后,酶标板孔中液体变黑,或产生黑色沉淀


酶标板孔中液体变黑,或产生黑色沉淀


可能原因:

1 HRP酶浓度过高:准备HRP酶工作液时,保证计算和配制体积准确,按照说明书中的洗涤体积、时间、次数进行洗板;

2 样本中指标浓度过高,样本还需要稀释;

3 终止液中硫酸浓度过高或变质:终止液是1M H2SO4,混用过高浓度的硫酸可能导致炭化反应。

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参考文献:

[1] Frey A, Meckelein B, Externest D, et al. A stable and highly sensitive 3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine-based substrate reagent for enzyme-linked immunosorbent assays[J]. Journal of immunological methods, 2000, 233(1-2): 47-56.

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