ELISA又称酶联免疫吸附测定，自1971年问世至今，已成为定量检测体液中各种靶标蛋白含量的常用方法。
ELISA呈色反应可进行定性或定量分析，利用HRP酶催化TMB，反应产生蓝色亚胺溶液，加入终止液后，使蓝色阳离子转变为黄色的联苯醌。
图：辣根过氧化物酶催化氧化3,3',5,5' -四甲基联苯胺[1]
除了常见的蓝色和黄色，ELISA实验过程中，也会出现一些不同寻常的多样色彩。每种颜色背后，都有着特殊含义。
接下来，我们将从ELISA的“外观”和“产出”两部分，解析藏在其中的色彩秘密。
一. 外观（组分）
01 · 粉红色
例1：为什么有的试剂盒内稀释液和浓缩生物素化抗体呈粉红色？
试剂盒的某些组分中，由于添加了特殊保护剂，会呈现红/粉色，例如QuicKey系列的酶结合物稀释液和E-EL-R0939的浓缩生物素化抗体。这种颜色的试剂性能正常，请按照说明书内操作要求放心使用。
02 · 黄色
例2：为什么稀释液呈淡黄色？
稀释液中含有防腐剂，正常情况下是澄清透明无异味的液体。如果稀释液变得浑浊、发臭、并且产生沉淀，大概率是被细菌污染，不建议再使用。
03 · 蓝色 / 黄绿色
例3：TMB底物溶液在使用前就变色？
TMB底物溶液未避光保存、敞口时间过久，会被空气中的HRP酶氧化，呈浅蓝/蓝色。这种情况下直接使用，会导致假阳性结果。所以，变蓝的TMB溶液，就不建议再继续使用了哦~
二. 产出（结果）
01 · 墨绿色 / 深蓝色
例4：加入底物溶液孵育后，酶标板孔溶液变成墨绿色或深蓝色
在正常的ELISA实验中，加入底物溶液孵育后，标曲前四孔出现明显蓝色梯度，即可终止反应。但是，当孵育的HRP酶结合物工作液浓度过高，或样本浓度远高于检测范围时，标曲最高1-2个梯度孔或样本孔可能会呈现墨绿色或深蓝色。
墨绿色样本终止反应后，在450nm波长下读取的OD值可能会比实际要低；深蓝色标曲会由于梯度OD值过于接近，无法拟合得到有效标曲并准确计算样本浓度。
建议：
（1）严格控制每一步的孵育温度和时间，按照说明书要求制备HRP酶结合物工作液；
（2）在显色阶段，通过前四孔出现明显蓝色梯度来控制显色时间；
（3）浓度过高的样本需要稀释到试剂盒检测范围内，再进行测定。
02 · 黄色
例5：终止反应后，整板变成黄色
可能原因：
1 竞争法按照夹心法操作：两者原理不同，操作步骤不同，请注意区分。
2 洗涤不当：甩板时离废液桶太近，导致液体反溅；甩板不干脆，导致液体残留或流入其他孔；洗涤时每孔注入的洗液不够，或洗涤次数不够；液体过多溢出污染；浸泡时间过短；
3 显色剂保存不当，或孵育时未避光，造成非特异性显色；
4 孵育温度过高，或孵育时间过长；
5 不同试剂盒组分混用或替代，产生基质效应或非特异性吸附，导致假阳性结果。
例6：标曲正常，样本孔全黄
读值计算后，发现标曲拟合效果良好，但样本OD超过标曲最大OD，表明样本还需要稀释哦。
03 · 黑色
例7：加入终止液后，酶标板孔中液体变黑，或产生黑色沉淀
可能原因：
1 HRP酶浓度过高：准备HRP酶工作液时，保证计算和配制体积准确，按照说明书中的洗涤体积、时间、次数进行洗板；
2 样本中指标浓度过高，样本还需要稀释；
3 终止液中硫酸浓度过高或变质：终止液是1M H2SO4，混用过高浓度的硫酸可能导致炭化反应。
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参考文献：
[1] Frey A, Meckelein B, Externest D, et al. A stable and highly sensitive 3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine-based substrate reagent for enzyme-linked immunosorbent assays[J]. Journal of immunological methods, 2000, 233(1-2): 47-56.