程浩 不同分离胶浓度与蛋白分离线性范围 分离胶浓度 线性分离范围 6% 50-150kDa 8% 30-90 kDa 10% 20-80 kDa 12% 12-60 kDa 15% 10-40 kDa... 实验指南及答疑 2018-11-19
程浩 不同浓缩胶体积所对应的各种组分的取样量 各种组分名称 不同浓缩胶体积所对应的各种组分的取样量 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 6 mL 8 mL 10 mL 5%浓缩胶 H 2 O 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30% Acrylamide 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7 1.0M Tris-HCl(pH 6.8) 0.13 0.25 0.38... 实验指南及答疑 2018-11-19
程浩 Western Blot不同分离胶体积所对应的各种组分 各种组分名称 不同分离胶体积所对应的各种组分的取样量 5 mL 10 mL 15 mL 20 mL 25 mL 30 mL 40 mL 50 mL 6% Gel H 2 O 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30% Acrylamide 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.0 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 1.3 2.5... 实验指南及答疑 2018-11-19
程浩 免疫组化试剂盒实验操作步骤 仪器、设备: 移液器、免疫组化笔、微波炉或高压锅、计时器、孵育湿盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶等。 溶液配制: PBS溶液配制;EDTA组织抗原修复液及DAB显色液使用详见免疫组化试剂盒产品说明书操作步骤。 实验温度: 15-28℃ 实验步骤: 1. 脱蜡水化 1) 石蜡切片置于新鲜的二甲苯中,浸泡15 min × 2次; 2) 去除多余的液体后,置无水乙醇中,浸泡3 min × 2次; 3... 实验指南及答疑 2018-07-16
张海涛 免疫组化抗体选择要点 一抗的选择要点 1. 选择单克隆还是多克隆抗体?由一种B细胞产生的单一特异性抗体叫做单克隆抗体,单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合,就像导弹精确地命中目标一样。另一方面,即使是同一个抗原决定簇,在机体内也可以由好几种B细胞产生抗体,形成抗体混杂物,称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中,一般单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小、检测抗原灵敏度相对较低;而多克隆抗体特异性稍弱、抗体的亲和力强、灵... 产品选购指南 2017-09-06
张海涛 Western Blot内参抗体选择原则 Western Blot 内参抗体种类很多,比如 β-actin 、 β-tubulin 、 GAPDH 、 Lamin B 等,那么针对自己的实验,我们该如何做选择呢 ? 下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则: 样本的种属来源 选择内参抗体首先要考虑的是实验样本的来源。 1. 哺乳动物的组织或者细胞样本,通常选择 β-actin 、 β-tubulin 、 GAPDH 、 Lamin B 、 ... 产品选购指南 2017-09-06
张海涛 二抗选择指南 二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体,在免疫学实验中,经常需要针对实验需求选择不同的二抗。通常情况下,某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择,如何能选择到最适合该实验的二抗,需要综合考虑以下几个方面: 1) 一抗的物种来源 2) 一抗的类别亚型 3) 二抗的偶联标记 4) 抗体的纯化方法 1. 一抗的物种来源 一抗是什么物种来源的,相应的二抗也要是抗该物种的抗体。例如,如果一抗是... 产品选购指南 2017-09-04
张海涛 如何明智选择抗体? 检测任何目的靶蛋白都有多种抗体可供选择,为缩小抗体的选择范围,选中合适的抗体,需要考虑如下几种因素: 1) 参考文献 2) 抗原表位 3) 抗体的应用范围 4) 抗体和样本的种属 5) 单抗和多抗的选择 1. 参考文献 通过查阅文献,核查其他研究人员在研究你的兴趣靶蛋白时用过哪些抗体,如果这些抗体应用范围与你的实验应用一致,可优先选择这些抗体。 2. 抗原表位 如果你研究的是靶蛋白的某一特定区域,... 产品选购指南 2017-09-04
程浩 石蜡切片免疫组化实验步骤 脱蜡和水化 1. 将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10 min,二甲苯Ⅱ(10 min)。 2. 再次浸入无水乙醇Ⅰ(5 min)-无水乙醇Ⅱ(5 min)-95%酒精(5 min)-80%酒精(5 min)-70%酒精(5 min),然后去离子水冲洗2次,每次2 min。 抗原修复 (可选) 3. 将组织切片放入修复盒,然后加入适量0.01M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)或EDTA修复液(pH 9.0),液... 实验指南及答疑 2017-09-02
程浩 免疫荧光实验指南 固定和透化 1. 在培养板中将已爬好细胞的盖玻片用1 × PBS浸洗3次,每次3 min。 2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min,1 × PBS浸洗玻片3次,每次3 min。 3. 0.5% Triton X-100(1× PBS配制 )室温通透细胞15 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤), 1 × PBS浸洗玻片3次,每次3min。 封闭 4. 吸水纸吸干1 ×PBS,在玻片上滴加5%... 实验指南及答疑 2017-09-02
程浩 免疫共沉淀实验指南 原理 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是利用抗原和抗体的特异性结合以及Protein A或G特异性地结合到抗体的Fc片段的现象探测两个蛋白分子间是否存在相互作用的一种方法。在细胞裂解液中加入针对蛋白M的抗体,孵育后再加入Protein A或G预处理的Sepharose珠,若细胞中有与蛋白M结合的蛋白N,就可以形成这样一种复合物:“蛋白N-蛋白M—抗蛋白M抗体—Protei... 实验指南及答疑 2017-09-02
程浩 免疫荧光常见问题分析 问题 原因 建议 背景过高 一抗质量不高 使用特异性高、效价高的一抗 一抗 / 二抗浓度太高 降低一抗 / 二抗浓度 封闭不完全 增加蛋白封闭时间 洗涤不充分 增加冲洗次数与时间 可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景 信号弱或无信号 无目的蛋白或表达量极少 选用表达量高的细胞或组织 细胞通透性差 增加通透剂的作用时间或浓度 一抗 / 二抗浓度太低 增大其浓度 二抗选择错误(种属不匹配) 选用与一抗... 实验指南及答疑 2017-09-01