增强型细胞活力检测试剂盒(CCK-8)是一种基于WST-8的快速、高灵敏度、非放射性比色检测试剂盒，广泛用于细胞增殖实验或细胞毒性实验。其基本原理为：试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，通过检测在450 nm处的吸光度，可以间接计算活细胞的量。
透过现象看本质，从实验原理我们可以了解到，CCK-8检测结果最终反映为OD值。然而，除了实验本身，其他因素引起的颜色变化也可能影响OD值的读数；同时，CCK-8实验主要评估样本中的脱氢酶总活性，任何影响脱氢酶活性的因素都可能导致OD值的波动。因此，CCK-8检测在操作不当的情况下容易产生异常结果。接下来，我们将探讨在CCK-8实验中可能遇到的异常情况，并提供相应的解决策略。
复孔差异大
除了本身操作误差的影响外，以下因素的影响也可能导致复孔差异大：
1、接种不均匀
①细胞悬液混匀不充分：在接种前，如果细胞悬液没有充分混匀，或者混匀过程中存在细胞沉淀，就容易导致接种时细胞分布不均匀，最终可能使不同孔差异较大。
②接种手法不当：接种时，如果加样速度过快、加样量不准确等，都可能导致细胞在孔板中的分布不均匀。
③细胞生长状态差异：如果细胞在接种前生长状态不佳，如细胞老化、凋亡等，或者细胞间存在生长差异，也可能导致接种后细胞分布不均匀。
优化方法
①确保细胞悬液混匀：在接种前，可以采用多次吹打、轻柔振荡等方法来确保细胞悬液的均匀性，避免细胞沉淀。
②优化接种技术：可以使用移液枪或适当的加样工具，斜贴着孔板壁加样，以减少平行孔间的误差。注意控制加样速度和加样量，确保每个孔的细胞数量一致。
③评估细胞生长状态：在接种前，使用倒置显微镜等工具对细胞进行显微镜检查，观察细胞形态和生长状态。确保使用新鲜、健康的细胞进行实验，避免使用老化或凋亡的细胞。
2、暴力加药
暴力加药可能会使细胞受到机械性损伤，影响细胞的生长和增殖能力，导致不同孔之间活细胞数量有差异，最终可能引起复孔OD值差异。
优化方法
温和加药：在加药过程中，应尽量避免暴力操作。应使用适当的移液器等工具，将药物缓慢、均匀地加入孔板中。同时，要注意控制加药速度和加药量，避免产生气泡和药物溅出。
3、液体蒸发
在96孔板等微孔板中，边缘孔由于更容易受到外部环境的影响（如温度波动、空气流动等），其蒸发速度通常比内部孔更快。这会导致边缘孔内的细胞生长环境与其他孔存在显著差异，从而产生所谓的“边缘效应”，影响实验结果的均一性和可靠性。
优化方法
①预加培养基或缓冲液：在接种细胞前，可以先在孔板的最外侧两排加入适量的培养基或缓冲液（如PBS），以减少内侧孔的液体蒸发。同时由于细胞培养箱的内部结构、风道设计等布局的影响，不同位置的温度可能有差异，推荐将孔板置于培养箱居中位置。
②减少培养时间：根据实验的具体需求和细胞生长特性，尽量缩短细胞在孔板中的培养时间，以减少液体蒸发的累积效应
4、检测前未混匀
CCK8试剂与细胞共同孵育后，会生成橙黄色的甲瓒产物，其颜色深浅与细胞数量及活性成正比。如果检测前未将孔内液体充分混匀，可能导致不同区域的甲瓒产物浓度不一致，从而在测定OD值时产生偏差。
优化方法
充分混匀孔内液体：在加入CCK8试剂并孵育一定时间后，轻轻晃动或敲击孔板，使孔内液体充分混匀。注意避免产生气泡，因为气泡会影响OD值的测定。如果孔内液体体积较大或细胞密度较高，可以考虑使用移液器轻轻吹打孔内液体，以进一步促进混匀。但需注意操作要轻柔，避免对细胞造成损伤。
组间差异小
不同组之间差异小，可能有以下一些原因：
1、细胞接种密度过大
当细胞接种密度过大时，基于细胞膜上糖蛋白的识别作用以及细胞间的相互作用，细胞会出现“接触抑制”，可能使得不同处理组之间的差异变得不明显。
优化方法
①优化细胞接种密度：通过预实验确定最佳的细胞接种密度。一般来说，应该确保细胞在培养过程中既不会过于稀疏也不会过于密集。这样可以使细胞在培养过程中保持良好的生长状态，同时减少因密度过高或过低而导致的误差。
②改善细胞培养条件：确保细胞在培养过程中获得充足的氧气、营养物质和生长空间。这可以通过定期更换新鲜培养基、使用透气性好的培养板和调整培养条件来实现。
2、药物的影响
①药物的氧化还原性质的影响：某些药物具有还原性（如维生素C），这些药物可能会与CCK-8发生显色反应，从而增加吸光度，导致测量结果偏高，进而掩盖了不同组间的真实差异。
另外药物中的金属离子（如氯化亚铅、氧化铁、硫酸铜等）也可能对CCK-8的显色反应产生抑制作用，降低检测灵敏度，从而使不同组之间的差异不明显。
②药物对细胞的直接影响：药物可能直接影响细胞的生长、增殖或代谢，但是由于药物浓度、作用时间等因素未达到显著差异的阈值，这种影响在不同组之间差异较小。
③药物颜色的影响：药物本身的颜色可能与CCK-8反应后生成的橙黄色甲瓒产物颜色相近或产生叠加效应，从而干扰了吸光度的准确测定。另外pH变化会导致溶液中的酚红变色，影响OD值的检测。这些干扰可能使得不同组的差异较小。
优化方法
①药物预处理：在加入CCK-8之前，更换新鲜培养基以去除药物对CCK-8测定可能产生的影响。特别是当药物具有氧化还原性质时，这一步骤尤为重要。
②优化药物浓度和作用时间：根据药物的特性（如IC50值）和实验目的，选择合适的药物浓度和作用时间进行实验。可以通过预实验来确定最佳的药物浓度和作用时间范围。
③设置合适的对照：通过比较实验孔、阴性对照孔与空白对照孔的吸光度差异，可以更准确地评估药物对细胞的影响。
3、孵育时间过长
CCK-8试剂与活细胞中的脱氢酶发生反应，生成橙黄色的甲瓒产物；随着孵育时间的延长，甲瓒产物的积累量逐渐增加，颜色逐渐加深，检测的OD值也因此上升。然而，当颜色达到一定程度后，可能会达到饱和状态，此时即使细胞活性存在差异，OD值的变化也不明显，从而导致组间差异减小。
优化方法
优化孵育时间：通过预实验确定最佳的孵育时间。在预实验中，可以设定不同的孵育时间点（如30分钟、1小时、1.5小时等），观察并比较各组在不同时间点的颜色变化和OD值，选择颜色变化明显且未达到饱和状态的时间点作为正式实验的孵育时间。
趋势对不上
除了上述两种异常情况外，CCK-8实验结果的趋势有时可能与其他实验结果的趋势不一致。这种情况可能是由前面提到的非正常因素引起的，但也有可能结果本身就是正常的。为了理解这种情况，我们需要弄清楚试剂盒实际检测的是哪些指标。此时，可以参考我们之前发布的相关推文：
希望今天的分享能帮助大家在CCK-8实验中游刃有余。精准的实验操作是获得可靠数据的关键，如果你有更多问题或想分享经验，欢迎在评论区留言！
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