细胞增殖是指细胞通过DNA复制、转录和蛋白质合成等复杂反应完成细胞分裂的过程，是活细胞重要的生理功能之一，检测细胞增殖是评价细胞生理状态、代谢稳态、病理状况、细胞活力等的重要指标。CFSE作为活细胞长时示踪染料，可对细胞进行荧光染色，相比 MTT 法或[3H]-thymidine 掺入等其它细胞增殖检测方法，具有更稳定、更灵敏、细胞毒性更低的优势。
1
CFSE检测原理
CFSE又称CFDA SE，是一种膜通透性的荧光素染料，本身不具有荧光发光性。当其透过细胞膜进入活细胞后，可被胞浆内的酯酶催化生成羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE），后者可发强烈的绿色荧光，不能穿透细胞膜，能完好的保留在胞内。CFSE 还可自发性并不可逆地与细胞内蛋白的氨基结合从而偶联到这些蛋白上，同时过量且未被偶联的CFSE 通过被动扩散回到细胞外培养基内，被后续清洗步骤所清除。
CFSE标记细胞的荧光均一稳定，在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记的荧光可分配至两个子代细胞中，荧光强度变为亲代细胞的一半，流式细胞仪检测获得的检测结果，根据其荧光强度的不同，可检测出未分裂，分裂一次（1/2的荧光强度），二次（1/4的荧光强度），三次（1/8的荧光强度），以及更多分裂次数的细胞。CFSE可检测分裂多达8次甚至更多次数的细胞。经 CFSE标记的细胞可用于体外和体内增殖研究，且不会使邻近细胞染色。CFSE标记的细胞呈绿色荧光，Ex=494 nm，Em=521 nm，可以用流式细胞仪或者荧光显微镜进行检测。
2
CFSE检测流程及注意事项
CFSE检测常用于细胞系样本和原代细胞样本，检测流程和注意事项如下：
染色流程 | 注意事项 |
试剂准备 | CFSE干粉较稳定，配制CFSE 储存液后应分装并置于-20°C 冰箱中密封避光，并于 1 个月内使用完； |
CFDA SE 易被水解，在水溶液中易变质，注意密封保存。 | |
细胞染色-细胞系和原代细胞 | 使用PBS作为染色稀释液，培养基或其他缓冲液中的叠氮化物、血清或蛋白质会与游离染料结合，可干扰细胞染色； |
调整细胞密度到 1 × 107 个/mL（最佳染色密度）； | |
37°C 细胞培养箱中避光时间孵育细胞染色时间控制在 10 分钟内，原代细胞不超过 5 分钟； | |
推荐CFSE的染色浓度为2.5~5 μM。 | |
其他细节 | 细胞离心洗涤的次数较多，为了尽可能降低离心洗涤带来的细胞损失，建议离心机设置中，调整离心力升速不大于3，降速不大于1，即Acc≦3，Dec≦1； |
CFSE在较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，复温溶解后可适当离心，充分吹打混匀再使用。 |
3
CFSE检测结果示例
图1. 体外诱导培养的小鼠骨髓来源树突状细胞使用LPS促成熟后和正常小鼠脾脏（使用E-CK-A345(CFSE)染色）进行共培养72 h后，再使用Elab Fluor Red 780 Anti-Mouse CD8a （E-AB-F1104S）和APC Anti-Mouse CD4（E-AB-F1097E）共染，并使用流式细胞仪检测T细胞的增殖情况。
以上就是CFSE检测细胞增殖的原理和操作注意事项。CFSE作为一种高效、灵敏的细胞增殖追踪工具，为科研人员提供了一种简便、可靠的细胞分裂监测方法。
