ELISA标曲异常的原因及对策(上)
ELISA实验中,标曲不仅能够帮助我们计算出样本浓度,还是指示实验人员操作手法是否规范的重要标志。本文介绍常见ELISA标曲异常的原因及对策

ELISA实验中,标曲不仅能够帮助我们计算出样本浓度,还是指示实验人员操作手法是否规范的重要标志。

问:如何判断我绘制的标准曲线是否有效呢?

答:在显色阶段,控制标准品前4孔有明显的蓝色梯度,以及标准品最大OD值≥1.2,标准曲线的线性回归相关系数R2≥0.99,即可作为有效标曲。

但是,在ELISA实验过程中,往往有标曲异常的情况出现,下面将介绍几种特殊情况,并将其原因与对策一一道来。

例1:整体偏低


标准品浓度

(pg/mL)

OD

1000

0.415

0.493

500

0.381

0.473

250

0.300

0.297

125

0.178

0.195

62.5

0.111

0.136

31.25

0.078

0.077

15.625

0.055

0.054

0

0.046

0.046

虽然标曲有一定梯度,但是最大OD值<1.2,梯度没有拉开。

可能原因:

1) 试剂盒过期或保存不当;

2) 标准品未溶解完全;

3) 加入终止液后,没有立即检测;

4) 试剂盒部分试剂(特别是洗涤液)混用其他批次,或为混用外源溶剂。

建议:

1) 按照说明书保存各组分,在保质期内使用;

2) 标准品溶解前,需要离心处理(10000×g离心1分钟),加入1.0mL标准品&样品稀释液后,静置1-2分钟,用低速涡旋仪充分混匀;

3) 加入终止液后,请立即进行检测。若需等待,放置在避光处的时间不宜超过10分钟;

4) 使用试剂盒内一套完整的试剂,不要混用其他批次或外源溶剂。

例2. 无信号


标准品浓度

(pg/mL)

OD

1000

0.047

0.045

500

0.047

0.044

250

0.048

0.045

125

0.049

0.044

62.5

0.049

0.046

31.25

0.049

0.045

15.625

0.048

0.046

0

0.046

0.044

标曲没有显色,OD值无梯度变化。

可能原因:

1) 试剂盒过期,或保存不当;

2) HRP酶受到污染,导致活力和效价降低;

3) 实验操作失误。例如:将生物素化抗体工作液和酶结合工作液的加样顺序颠倒;

4) 订购多个指标,实验时混用标准品、酶标板、生物素化抗体等。

建议:

为了快速排查原因,请尝试混合10μL底物溶液和2μL浓缩HRP酶,观察是否发生颜色变化,并及时对显色结果拍照。

如果有颜色变化(混用后呈现深蓝色/蓝绿色),表明HRP酶和TMB并无污染问题,可重新取一条板条,在避免以上问题的情况下制作标曲。

例3:整体偏高


标准品浓度

(pg/mL)

OD

1000

7.504

4.389

500

6.228

4.168

250

4.835

3.654

125

3.042

5.043

62.5

1.704

3.882

31.25

0.985

4.322

15.625

0.617

3.996

0

0.348

4.154

酶标仪仪器光密度范围过广,导致检测OD值范围也很高。建议光密度范围设置在0-3.5之间。


标准品浓度

(pg/mL)

OD

1000

OVER

OVER

500

3.477

3.466

250

3.256

3.27

125

2.871

2.532

62.5

1.924

1.857

31.25

1.16

1.137

15.625

0.741

0.74

0

0.107

0.087

可能原因:

部分OD值超出仪器检测范围,可能是由于工作液浓度过高,或孵育时间过长/温度过高

建议:

1) 按照说明书要求,在工作液使用前15分钟,将浓缩液于800×g离心1分钟,以浓缩液:稀释液=1:99的比例,现配现用;

2) 孵育箱或烘箱需控制温度恒定37℃,温差不超过1℃,底物反应时间为15分钟左右。建议根据标准孔前4孔出现明显蓝色梯度,来控制实际显色时间,显色时间酌情缩短或延长,但不可超过30分钟。

例4:全阳性


标准品浓度

(pg/mL)

OD

1000

3.402

3.461

500

3.541

3.466

250

3.729

3.576

125

3.773

3.527

62.5

3.737

3.488

31.25

3.578

3.648

15.625

3.635

3.557

ELISA实验FAQs 之试剂盒、样本、数据处理
本文主要介绍ELISA试剂盒、实验样本、ELISA数据处理相关问题,帮助大家更好地开展实验。