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Treg细胞简介及指标选择

介绍Treg细胞，并讲解其检测指标及实例分析

Th1/Th2/Th17和Treg细胞是流式实验中常见的T细胞检测对象，往期的流式课堂给大家介绍了Th1/Th2/Th17细胞简介及指标选择 ，今天给大家简要介绍Treg细胞，并讲解其检测指标及实例分析。

01 什么是Treg细胞？

Treg（调节性T细胞，Regulatory T cells）是免疫系统的重要调节细胞，对维持自身耐受性和免疫细胞稳态至关重要，它由胸腺产生后输出至外周，并通过主动调节的方式抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，从而调节机体的免疫力。目前，最常用的鉴别Treg的标志Marker是CD4、CD25、CD127和Foxp3。Treg在免疫耐受、自身免疫病、感染性疾病、器官移植及肿瘤等多种疾病中发挥重要的作用。

02 Treg细胞分类及标志物

根据发育来源，Treg细胞可分两类：

◇一类是天然产生的自然Treg（nTreg），主要在胸腺里分化发育而来，主要包括CD4⁺Treg细胞。

◇另一类是经诱导产生的适应性Treg（iTreg），是由初始CD4⁺T细胞（Th0）经抗原刺激后分化发育而来，包括Tr1细胞、Th3细胞和CD8⁺Treg细胞等多种亚型，肿瘤微环境中的Treg主要就是指iTreg细胞。

Treg细胞发育流程

图1：Treg细胞发育流程

分类		表型	标志物
自然Treg细胞	nTreg	CD4⁺CD25⁺	Foxp3，LAG-3、neuropilin-1
适应性Treg细胞	Tr1	CD4⁺CD25^-	CD25^low/variable， CD45RB^low
	Th3	CD4⁺CD25⁺fromCD25^- precursors	CD25^low/variable， CD45RB^low，Foxp3⁺
	CD8⁺ Treg	CD8⁺CD25⁺	Foxp3⁺，CD28^-

03 Treg细胞检测指标选择

要检测Treg细胞，应当如何选择指标呢？根据过往的实验经验，为大家进行了如下总结：

样本物种	检测指标
Human	CD3, CD4, CD25, Foxp3, CD127(low/-)
Mouse	CD3, CD4, CD25, Foxp3

1.CD3、CD4表达量较高。

2.蓝色表示重要/表达较低的指标，需要搭配强荧光素。

3.FOX和CD127只需选择一个即可，Foxp3为核内因子，检测时需要固定破膜（E-CK-A108）；CD127是细胞表面Marker，则不需要固定破膜。

04 Treg细胞检测案例

小鼠脾脏Treg（3色）检测

Panel Design&样本管设置：

目的	样本	设置
调电压	1	Blank（空白管）
调补偿	2	CD4-FITC
	3	CD25-APC
	4	Foxp3-PE
APC-FMO联合同型对照划门	5	CD4-FITC、Foxp3-PE、Rat IgG1, κ Isotype Control-APC
PE-FMO联合同型对照划门	6	CD4-FITC、CD25-APC、Mouse IgG1, κ Isotype Control-PE
Full Panel	7	CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE

流式抗体信息：

指标	荧光标记	克隆号	货号
CD4	FITC	GK1.5	E-AB-F1097C
CD25	APC	PC-61.5.3	E-AB-F1102E
Foxp3	PE	3G3	E-AB-F1238D
Rat IgG1, κ Isotype Control	APC	HRPN	E-AB-F09822E
Mouse IgG1, κ Isotype Control	PE	MOPC-21	E-AB-F09792D

图2.小鼠脾脏Treg（3色）检测结果

如上图所示，根据FSC/SSC圈出淋巴细胞群，去除粘连体之后，根据CD4⁺圈出CD4⁺T淋巴细胞群，最后通过CD25⁺Foxp3⁺确定Treg细胞群。

注意事项：

1. 小鼠Treg的标记是CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺。

2.CD4分群明显，无需同型对照，CD25和Foxp3分群不明显，需同型对照。

3.荧光素间有溢漏，故需要设置单阳管用于调节补偿。

4.破膜剂使用不当会造成很高的背景以及细胞分群不明显。

人外周血Treg（6色）检测

Panel Design&样本管设置：

目的	样本	设置
调电压	1	Blank（空白管）
调补偿	2	CD45-Elab Fluor^® Violet 450
	3	CD3-Elab Fluor^®Red 780
	4	CD4-FITC
	5	CD8a-PerCP/Cyanine5.5
	6	CD25-PE
	7	CD127-Elab Fluor^®647
Full Panel	8	CD45-Elab Fluor^® Violet 450、CD3-Elab Fluor^® Red 780、CD4-FITC、CD8a-PerCP/Cyanine5.5、CD25-PE、CD127-Elab Fluor^® 647

流式抗体信息：

指标	荧光标记	克隆号	货号
CD45	Elab Fluor^® Violet 450	HI30	E-AB-F1137Q
CD3	Elab Fluor^® Red 780	OKT3	E-AB-F1001S
CD4	FITC	RPA-T4	E-AB-F1109C
CD8a	PerCP/Cyanine5.5	OKT-8	E-AB-F1110J
CD25	PE	BC96	E-AB-F1194D
CD127	Elab Fluor^® 647	A019D5	E-AB-F1152M

人外周血Treg（6色）检测结果

图3.人外周血Treg（6色）检测结果

如上图所示，根据CD45⁺和SSC圈出淋巴细胞群，去除粘连体之后，根据CD3⁺圈出T淋巴细胞群，再根据CD4⁺CD8^-圈出CD4⁺T淋巴细胞群，最后通过CD25⁺CD127^-/low确定Treg细胞群。

注意事项：

1.传统的通过检测Foxp3鉴定Treg的方法操作相对复杂，且固定破膜步骤对实验者要求较高，目前通常通过CD127来检测人Treg。

2.增加CD45指标，便于淋巴细胞圈门，直接通过CD45和SSC圈出淋巴细胞门，分析CD4⁺CD25⁺CD127^-/low的细胞比例，正常人外周血中Treg细胞在淋巴细胞中占比为3%~10%。

3.需要设置单阳管用于调节补偿。

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