流式细胞术是一项非常实用的技术,其特点是方便快捷,结果准确,且能成功的对目标细胞进行分选,但是提起流式抗体具体要怎么选,估计很多小伙伴都会犯难,确实,想获得一个漂亮的流式结果图没有那么容易,实验前最需要考虑的是抗体的选择和荧光素的搭配。
选流式抗体需注意哪些问题?
抗体的基本要求
a. 清楚知道待测靶标是胞内还是胞外蛋白;
b. 严格按照样品来源选择抗体反应性;
c. 必须选择明确标注可用于流式实验的抗体,不能用普通抗体代替。
流式细胞仪的要求
a.了解所用的流式细胞仪有几个激光器,常见的激光器有405nm、488nm和633nm等,目前大部分的流式细胞仪都配有488nm和633nm2个激光器;
b. 知道每个激光器下有几个检测通道,通道数决定一次最多测多少个指标;
荧光标记的选择
a. 有直标抗体的话,尽量选直标,间接标记二抗增加实验步骤,多次清洗造成会细胞损失,染色准确性也低;
b. 弱表达靶标,尽量选择强荧光素标记抗体,PE>APC>FITC>PerCP。
多色搭配方案
a. 每个通道只能用一种标记,如FITC和AF488,两种标记的激发波长和发射波长均相近,所以不能同时用这两种标记;
b. 尽量减少光谱重叠,如PE-cy5和APC,两者同用时调补偿值过大;
c. 弱靶标配强荧光素,如Treg细胞中CD4表达量高于FoxP3,所以FoxP3应使用强荧光素标记抗体;
d. 五色及以上配色建议查阅文献,或者咨询抗体厂商。
如何调补偿?
多色流式实验,由于各个荧光素存在光谱的重叠,因此需要进行补偿调节,下图为FITC和PE两种荧光素的光谱图,在550nm附近,两种染料存在光谱重叠。
下图为CD3-FITC,CD4-PE的染色补偿调节过程,调补偿最简单的一个词就是:“横平竖直”,慢慢理解哦!
同型对照?
同型对照的目的是为了减少背景干扰,更好展现抗原与抗体的结合强度,尤其对于一些胞内蛋白、低表达或连续表达蛋白,同型对照的设置显得尤为必要。同型对照需要选择与染色的单克隆抗体相同种属来源,相同抗体亚型,相同荧光标记的抗体。
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